基于瓊脂糖-中性紅法的簡易空斑試驗應(yīng)用研究*

金 鑫，余福勛，楊 麗，余本莉，崔玉霞，葉芝旭,△

(1.貴州省人民醫(yī)院眼科，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院中心實驗室/國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫疾病重點實驗室，貴州 貴陽550002；3.貴州省人民醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550002)

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界嬰幼兒和老年人病毒性呼吸道感染的主要原因，其每年造成的死亡人數(shù)超過流感。幾乎所有2歲以下兒童均感染過RSV。嚴(yán)重的RSV感染與兒童反復(fù)喘息及哮喘有關(guān)[1-2]。因此，RSV感染越來越受到重視，研究RSV致病機制、研發(fā)抗RSV藥物及疫苗均需進(jìn)行RSV滴度定量測定?？瞻咝纬稍囼炇菧y定病毒滴度的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在國內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用。與甲基纖維素相比，瓊脂糖更容易覆蓋細(xì)胞單層[3-4]，但方法不當(dāng)時，不易形成空斑。本研究應(yīng)用瓊脂糖覆蓋細(xì)胞單層、中性甲醛固定及中性紅染色的試驗流程檢測病毒滴度，能形成合適的空斑，方法簡單且重復(fù)性較好，為進(jìn)一步進(jìn)行RSV相關(guān)基礎(chǔ)研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料 人喉上皮癌細(xì)胞Hep-2及RSV A2標(biāo)準(zhǔn)株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸病研究室惠贈。胎牛血清購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM液體培養(yǎng)基和干粉培養(yǎng)基分別購自美國Gibco公司和Hyclone公司；Triton X-100、BSA、中性紅、胰酶和低熔點瓊脂糖購自北京Solarbio公司；鼠抗RSV N抗體購自英國ABCam公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗熒光二抗購自北京Bioss公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自上海碧云天公司。

1.2方法

1.2.1RSV感染細(xì)胞模型的建立 未感染RSV的Hep-2細(xì)胞作為空白對照組，感染RSV的Hep-2細(xì)胞作為試驗組，每組4個孔。Hep-2細(xì)胞按6×105/孔鋪板于12孔板中，待細(xì)胞單層生長至80%時，將感染復(fù)數(shù)為0.01的病毒液[用含2%胎牛血清(FBS)的DMEM稀釋病毒液]按每孔400 μL加入細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO2條件下吸附2 h,每15～30分鐘搖動1次，以保證病毒分布均勻。吸附2 h后棄上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，以去除未被吸附的病毒。再次加入新的含2%FBS的DMEM每孔1 mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，顯微鏡下可觀察到明顯的細(xì)胞病變。收集標(biāo)本，其中上清液用于測定病毒滴度，采用免疫熒光檢測方法檢測RSV N蛋白。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光檢測 RSV感染Hep-2細(xì)胞后48 h，去除培養(yǎng)上清液，感染細(xì)胞用PBS洗滌3次，4%甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，再用含1%牛血清清蛋白(BSA)和0.3%Triton X-100的PBS封閉，同時打孔30 min。然后加入小鼠抗RSV N抗體(1∶200，1%BSA作稀釋液)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，再加入FITC標(biāo)記的抗小鼠二抗(1∶300，1%BSA作稀釋液)，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌3次，加入DAPI染液常溫避光染色30 min，PBS洗滌3次，采用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝。

1.2.3簡易空斑試驗方法 Hep-2細(xì)胞以每孔3×105接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，達(dá)到100%融合時，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次。在冰盤上將病毒懸液以含2%FBS的DMEM作10倍系列稀釋，共8個稀釋度(10-8～10-1)。每一稀釋濃度設(shè)2個復(fù)孔，每孔分別接種200 μL病毒液，于37 ℃、5%CO2條件下吸附2 h,每15～30分鐘搖動1次，以保證病毒分布均勻，對照組僅加入含2%FBS的DMEM。吸附2 h后棄上清液，PBS洗滌2次，以去除未被吸附的病毒。加入瓊脂糖覆蓋層，瓊脂糖覆蓋層由1%低熔點瓊脂糖(瓊脂糖以滅菌注射用水配制，高壓滅菌處理，臨用前微波爐加熱融化，于42 ℃水浴保溫備用)及含5%FBS的2×DMEM(42 ℃保溫備用)按1∶1配制而成，使瓊脂糖濃度為0.5%，F(xiàn)BS濃度為2.5%，DMEM為1×DMEM。每孔加入上述瓊脂糖混合液1 mL，覆蓋細(xì)胞，室溫下靜置20 min后置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。觀察并記錄Hep-2細(xì)胞形成典型融合病變，即空斑的時間、形態(tài)及數(shù)量。培養(yǎng)5～6 d后，每孔加入1 mL10%甲醛固定細(xì)胞，1 h后小心去除瓊脂糖覆蓋層并用雙蒸水輕輕沖洗，每孔加入0.05%中性紅染液1 mL，常溫染色過夜，次日去除中性紅染液，自然晾干后肉眼計數(shù)空斑個數(shù)。將每孔記數(shù)為10～100的空斑數(shù)帶入計算公式，并按如下公式計算病毒滴度。病毒滴度=(每孔平均空斑個數(shù)×病毒稀釋度倒數(shù))/每孔病毒接種量。

2 結(jié) 果

2.12組典型細(xì)胞病變情況 試驗組形成典型合胞病變，即感染細(xì)胞發(fā)生融合后形成多核巨細(xì)胞，直徑為1.5～2.5 mm，合胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞界限不清；空白對照組未見典型細(xì)胞病變。見圖1。

A為空白對照組，B為試驗組。

2.22組RSV N蛋白表達(dá)檢測結(jié)果比較 試驗組有綠色熒光表達(dá)，且可見細(xì)胞核聚集現(xiàn)象；空白對照組未檢測到非特異性的熒光標(biāo)記。見圖2。

A為空白對照組，B為試驗組。

2.3RSV感染Hep-2細(xì)胞后形成的空斑 中性紅染色后，正常Hep-2細(xì)胞呈紅色，而RSV感染的Hep-2細(xì)胞不能染色，形成空斑。鏡下空斑形態(tài)與RSV形成的合胞病變一致(圖3A)。空斑肉眼清晰可見，為類圓形或圓形，大小1.5～2.5 mm，邊緣不規(guī)則。隨著病毒稀釋度的增高，空斑數(shù)目逐漸較少(圖3B)。偶有部分細(xì)胞因去除瓊脂糖覆蓋層時不慎刮傷細(xì)胞，導(dǎo)致中性紅染色時亦不著色，但刮傷的細(xì)胞處肉眼可辨別出來，多成條索狀。計算2個復(fù)孔并取平均值，最后計算出病毒滴度為7.5×108PFU/mL。

A.鏡下空斑形態(tài)(400×);B.肉眼空斑，其中1～3未感染RSV，4～8病毒稀釋度為10-8～10-4。

3 討 論

RSV是導(dǎo)致全世界嬰幼兒病毒性肺炎最常見的病毒病原,可分為A、B兩種抗原亞型，其中RSV A2株是最常用于試驗研究的標(biāo)準(zhǔn)株[5]。研究RSV的致病機制、抗病毒藥物的篩選及新藥開發(fā)等均需要對病毒滴度進(jìn)行測定。既往采用TCID50測定病毒滴度，但操作繁瑣、耗時且結(jié)果判斷有很大的主觀性[6]。病毒空斑試驗于1952年由Dulbecco首次描述用于檢測動物病毒，并在1954年用于檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒[7-8]。經(jīng)過接近70年的不斷改進(jìn)及優(yōu)化，病毒空斑試驗已是目前公認(rèn)的測定病毒滴度的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9-11]。在臨床前和臨床研究中，病毒空斑試驗是開發(fā)和評價新的抗病毒藥物或疫苗的重要工具。凡是感染后能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的病毒都可以用空斑試驗檢測病毒滴度。采用空斑法可對呼腸孤病毒[11]、輪狀病毒[12-13]、新型冠狀病毒[14]、副流感病毒、RSV[3]等進(jìn)行病毒滴度檢測。免疫法采用抗體標(biāo)記RSV抗原蛋白，而后借助熒光顯微鏡計數(shù)空斑數(shù)，可將檢測時間縮短至3 d。但該方法需要使用較昂貴的抗RSV抗體及二抗，且需使用熒光顯微鏡，導(dǎo)致成本較高、操作繁瑣、重復(fù)性欠佳[9]。

本研究采用的簡易空斑試驗原理：RSV感染致密成片的Hep-2細(xì)胞后，然后覆蓋一層瓊脂糖半固體培養(yǎng)基，病毒感染細(xì)胞并在細(xì)胞中增殖，使細(xì)胞發(fā)生病變死亡。由于半固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周圍擴散，數(shù)天后可出現(xiàn)典型的細(xì)胞融合病變。去除瓊脂糖覆蓋層，細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后用中性紅染色，未被感染的細(xì)胞被染成紅色，而死細(xì)胞不能染色，因此出現(xiàn)肉眼可見的病毒空斑。理論上，當(dāng)病毒液充分稀釋后，每一個空斑由1個感染性病毒顆粒繁殖并破壞細(xì)胞后形成，因此通過空斑數(shù)可精確測定病毒滴度[9]。RSV簡易空斑試驗通常在6～24孔板中進(jìn)行，常用對RSV最易感的Hep-2細(xì)胞，易于形成典型的空斑。用來做培養(yǎng)基覆蓋的物質(zhì)包括瓊脂糖、明膠、甲基纖維素等。常規(guī)RSV空斑試驗采用低熔點的瓊脂糖作為覆蓋層。既往采用3%固體瓊脂糖覆蓋后形成的空斑偏小，且需培養(yǎng)9～13 d后在顯微鏡下人工計數(shù)空斑[9]，固體瓊脂糖融化后易于凝固，操作時溫度難以把握，常因溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或溫度過低導(dǎo)致凝固，且非常耗時。近年來，采用0.6%或1%瓊脂糖[3,15]，即半固體瓊脂糖制作覆蓋層。瓊脂糖在較低溫度下不易凝固，形成空斑的時間可縮短至5～7 d，空斑更大，可肉眼觀察，操作簡單，可重復(fù)性強[3]。常用于空斑試驗的染料包括中性紅、結(jié)晶紫等。有研究比較了瓊脂糖-中性紅法及甲基纖維素-結(jié)晶紫法對嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒空斑檢測的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法測定到的病毒滴度無明顯差異[16]。瓊脂糖-中性紅法是最為常用的檢測各種病毒滴度的方法。細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后再用中性紅染色，只有活的細(xì)胞才能攝取中性紅，使細(xì)胞被染色，而死亡的細(xì)胞則不能染色形成空斑，且染色結(jié)果可長期保存[9]。

本研究中，RSV A2株感染Hep-2細(xì)胞后，顯微鏡下可形成典型的合胞病變，通過免疫熒光染色RSV N蛋白，可檢測到RSV N蛋白表達(dá)，提示RSV成功感染Hep-2細(xì)胞?？瞻咴囼炛?，半固體瓊脂糖覆蓋細(xì)胞，經(jīng)甲醛固定后并用中性紅染色，可見到形成合胞病變處的細(xì)胞不被染色形成空斑，而未感染的細(xì)胞被染成紅色，因而可直觀通過空斑個數(shù)計算病毒滴度。本試驗需要注意以下幾點：(1)空斑試驗所用的Hep-2細(xì)胞應(yīng)處于最佳狀態(tài)，鋪板均勻，幾乎100%長滿培養(yǎng)板時，試驗結(jié)果最佳，應(yīng)防止細(xì)胞生長過密或接種時細(xì)胞生長過久；(2)2×DMEM培養(yǎng)基配制后如放置時間過久，需注意pH值的變化，不適宜的pH值會導(dǎo)致細(xì)胞死亡；(3)瓊脂糖為低熔點瓊脂糖，且覆蓋時溫度適宜，覆蓋時動作要緩慢，防止氣泡產(chǎn)生，同時動作要快，防止混合物凝固及細(xì)胞因長時間脫離培養(yǎng)基或液體而死亡；(4)第1次做空斑試驗時，每隔12 h觀察1次細(xì)胞病變，了解細(xì)胞病變所需時間，避免觀察時間太晚導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。

綜上所述，基于瓊脂糖-中性紅法的簡易空斑試驗可直接觀察空斑計算病毒滴度，不需要進(jìn)行免疫熒光染色和顯微鏡檢查，且檢測結(jié)果可無限期保存，具有試驗方法簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點。該方法可成功測定RSV病毒滴度，并可為后續(xù)RSV相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。