6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞炎癥通路和抗氧化作用的影響

黃敏，程珂，馬春松，王猛，王春芳,2

1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070； 2.長江經濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心/湖北省池塘健康養(yǎng)殖工程實驗室,武漢 430070

據《中國藥典》記載，生姜是姜科植物姜的新鮮根莖，具有食用和藥用價值。近年來，生姜制劑已經越來越多地運用在水產行業(yè)中，如飼料添加劑[1]、免疫增強劑[2]、魚病防治劑[3]等。姜烯酚類(shogaols)是生姜中姜辣素的主要成分之一[4]，而姜烯酚中的6-姜烯酚，因其具有抗炎[5]、抗氧化應激[6]、抗腫瘤[7]作用而備受關注。

6-姜烯酚的抗炎和抗氧化作用研究多以哺乳動物如大鼠[8]、人類[9]細胞等為模型，在魚類中鮮有報道。在人類醫(yī)學研究中，6-姜烯酚抑制了NF-κB信號通路的活化，對巨噬細胞、CD4細胞、小膠質細胞等細胞中抗炎因子如iNOS、COX-2 和IL-6等的表達有抑制作用[10-11]；可以抵抗人健康腸上皮細胞受到H2O2刺激而產生的氧化作用[6]。關于生姜有效成分在魚類中的相關研究，主要體現(xiàn)在防治魚病如腸炎[12]和小瓜蟲病[13]，以及一些免疫學指標變化表象的觀察[14]，而對于生姜的各種活性成分的效用和作用機制還鮮有探究。

斑馬魚作為一種廣泛使用的模型生物，其基因與人類達到了87%的相似性[15]。斑馬魚肝臟細胞與哺乳動物表型相似，細胞功能相同，部分信號通路和受損傷機制與哺乳動物多有相似之處[16]，可作為藥物檢測的模式生物。本研究通過探究不同濃度6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞的增殖、抗氧化以及炎癥通路相關基因表達的影響，探究6-姜烯酚是否能影響斑馬魚肝臟細胞中免疫功能，以期為6-姜烯酚作為免疫增強劑在水產飼料中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及試劑

斑馬魚肝臟細胞來自華中農業(yè)大學水產學院水生動物細胞保藏中心。

6-姜烯酚購自上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%；雙抗(青霉素-鏈霉素)、兩性霉素B、硫酸慶大霉素(50 mg/mL)購自Omega(美國)；胎牛血清(FBS)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、Ham’s F-12營養(yǎng)培養(yǎng)基(F-12)、Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基(L-15)購自Gibco(美國)；活性氧測定試劑盒(DCFH-DA)購自泛博生物化學有限公司(北京，中國)；CCK-8購自日本同仁公司；SOD(測分型)試劑盒、細胞丙二醛測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法；鉬酸銨法)購自南京建成生物工程研究所(南京，中國)；組織細胞總谷胱甘肽檢測試劑盒購自普里萊公司(北京)；Trizol購自Invitrogen(美國),cDNA合成試劑盒PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 購自TaKaRa(日本)，qPCR試劑盒Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)購自Yeasen公司(上海，中國)。

1.2 培養(yǎng)基的配制

斑馬魚肝臟細胞培養(yǎng)基：L-15 48%、DMEM 32%、F-12 15%、FBS 4%、雙抗 1%。

6-姜烯酚復合培養(yǎng)基：6-姜烯酚粉末用L-15溶液溶解稀釋，配制成0、10、20、40、80 μmol/L的6-姜烯酚復合培養(yǎng)基。濃度設置參考6-姜酚(40 μmol/L)作用于小鼠巨噬細胞[17]、6-姜烯酚 (10～45 μmol/L)作用于子宮內膜癌細胞的濃度[18]。

1.3 6-姜烯酚孵育斑馬魚肝臟細胞

用斑馬魚肝臟細胞培養(yǎng)基混勻稀釋細胞(密度約為5×105個/mL)并加到細胞培養(yǎng)板中于28 ℃培養(yǎng)箱(含5% CO2)中培養(yǎng)過夜，待斑馬魚肝臟細胞貼壁后將原培養(yǎng)基吸出，向每孔中加入100 μL(96孔板)或400 μL(24孔板)的含有不同濃度6-姜烯酚的復合細胞培養(yǎng)基(濃度分別為0、10、20、40、80 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h換液1次，直至孵育48 h。

1.4 生長率檢測

將本文“1.3”中的96孔細胞培養(yǎng)板中溶液吸出后，加入不含F(xiàn)BS和雙抗的培養(yǎng)基并向每孔加入10 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板放在28 ℃培養(yǎng)箱內孵育3 h，用酶標儀Infinite M200 NanoQuant (Tecan,瑞士)測定450 nm處的吸光度。

1.5 活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測

將DCFH-DA與不含F(xiàn)BS和雙抗的培養(yǎng)基按1∶1 000比例稀釋，28 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。用PBS洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用多功能酶標儀SpectraMax?i3x(Molecular Devices,美國)使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測熒光強度，實驗過程全程避光。用熒光顯微鏡(Leica DMi8,德國)拍攝各濃度組熒光強度照片。

1.6 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)活性檢測

將板內培養(yǎng)基吸出，加入胰酶消化細胞，按照SOD試劑盒(測分型)說明書中的方法操作，于酶標儀Infinite M200 NanoQuant (Tecan,瑞士)波長550 nm處測定各處理組的吸光度值。

1.7 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測

消化收集24孔板細胞，按照試劑盒說明書操作，同時測定蛋白濃度，于酶標儀Infinite M200 NanoQuant (Tecan,瑞士)波長530 nm處測定各處理組的吸光度值。

1.8 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性檢測

消化收集24孔板細胞，超聲破碎細胞取上清，按照試劑盒說明書操作，同時測定蛋白濃度，于酶標儀Infinite M200 NanoQuant (Tecan,瑞士)波長340 nm處測定各處理組的吸光度值。

1.9 過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測

消化收集24孔板細胞(100 μL每孔)，超聲破碎細胞取上清，其余步驟同本文“1.8”， 測定波長405 nm處各處理組的吸光度值。

1.10 總RNA提取和相關基因的表達分析

在T25細胞培養(yǎng)瓶中加入1 mL TRIzol裂解細胞，收集裂解液于1.5 mL EP管中，每管加入0.2 mL氯仿，室溫振蕩孵育2～3 min，11 304 r/min離心15 min。小心吸取離心后上層無色液體(RNA)移入新的EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫下孵育15 min，11 304 r/min離心15 min。去上清，獲得沉淀加入75%乙醇1 mL，漩渦振蕩30 s，4 ℃ 8 937 r/min離心5 min。去上清，沉淀在通風櫥靜置干燥3～5 min，加入20 μL DEPC水溶解。獲得的RNA經過質檢之后用于cDNA的合成，操作方法參照PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑盒說明書進行。得到的cDNA于-20 ℃保存。

用熒光定量qPCR法，以β-actin為內參基因，檢測斑馬魚相關基因在細胞中的相對表達情況。qPCR使用 QuantStudioTM6 Flex Real-TimePCR System (Thermo Fisher Scientific,美國)平臺，反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，(55～60 ℃) 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。反應體系為：HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)10 μL,上下游引物 (10 μmol/L) 各0.4 μL (引物序列見表1),cDNA 2 μL,加無菌蒸餾水至20 μL。結果采用2-ΔΔCt方法分析。

表1 試驗所用引物序列 Table 1 Primer information used in the current study

1.11 統(tǒng)計學處理

所有獲得的原始數(shù)據以“平均值(Mean)±標準誤(SE)”表示，并采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。Shapiro-willkgp’s 檢驗用于正態(tài)分布檢驗，Leven’s 進行方差齊性檢驗，單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行方差分析，若組間差異顯著(P<0.05)，用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞生長率的影響

如圖1所示，與未用6-姜烯酚孵育的空白組相比，經過6-姜烯酚孵育后的細胞生長率受到抑制，且隨著濃度提高，抑制作用越強(P<0.05)。

設定6-姜烯酚0濃度組生長率為100%，不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)。The growth rate of 6-shogaol with a concentration of 0 wasset as 100%.There are significant differences between the different letter representations (P<0.05).

2.2 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞ROS的影響

如圖2A所示，與未用6-姜烯酚孵育的空白組相比，經過6-姜烯酚孵育后的細胞ROS熒光值在10 μmol/L和20 μmol/L濃度的6-姜烯酚處理組顯著降低(P<0.05)，其余濃度處理組ROS熒光值也有一定下降，但與未添加6-姜烯酚的對照組相比無統(tǒng)計學意義，圖2B中熒光的強度表示ROS含量。

2.3 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞SOD活性的影響

如圖3所示，與未用6-姜烯酚孵育的空白組相比，經過6-姜烯酚孵育后的肝臟細胞中SOD活性升高，在20 μmol/L時達到高峰(P<0.05)。

2.4 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞MDA含量的影響

如圖4所示，經過6-姜烯酚孵育后的斑馬魚肝臟細胞與未用6-姜烯酚孵育的組相比，其MDA含量顯著下降(P<0.05)，其中20、40 μmol/L濃度組含量最低，與SOD成負相關趨勢。

A：斑馬魚肝臟細胞內ROS熒光值，不同字母表示ROS熒光值有顯著性差異(P<0.05)； B：斑馬魚肝臟細胞ROS產生情況，綠色熒光代表含有ROS的細胞。 A：ROS fluorescence values in the cells of zebrafish liver,and different letters indicate significant differences in ROS fluorescence values (P <0.05); B：Production of ROS in zebrafish liver cells.Green fluorescence represents cells containing ROS.

不同字母表示不同處理組間有顯著性差異(P<0.05)。下同。 Different letters indicate significant differences among different treatment groups (P<0.05).The same as below.

圖4 不同濃度6-姜烯酚孵育后斑馬魚肝臟細胞MDA的含量Fig.4 MDA contents in zebrafish liver cells after incubation of different concentrations of 6-shogaol

2.5 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞GSH-PX活性的影響

如圖5所示，經過6-姜烯酚孵育后的細胞與未用6-姜烯酚孵育后的細胞相比，除40 μmol/L濃度組外GSH-PX活性均顯著上升(P<0.05)。

圖5 不同濃度6-姜烯酚孵育后斑馬魚肝臟細胞GSH-PX活性Fig.5 GSH-PX activity of zebrafish liver cell after incubation of different concentrations of 6-shogaol

2.6 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞CAT活性的影響

如圖6所示，經過6-姜烯酚孵育后的細胞與未用6-姜烯酚孵育后的細胞相比，CAT活性均顯著上升(P<0.05)，其中10 μmol/L濃度組活性顯著高于其他組(P<0.05)。

圖6 不同濃度6-姜烯酚孵育后斑馬魚肝臟細胞CAT活性Fig.6 CAT activity of zebrafish liver cells after incubation of different concentrations of 6-shogaol

2.7 6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞NF-κB和Keap1-Nrf2/HO-1通路相關基因表達的影響

如圖7所示，6-姜烯酚顯著上調斑馬魚肝臟細胞中nf-κb的表達量，在10、20 μmol/L濃度下nf-κb表達量達到高峰(P<0.05)。炎癥因子il-6和tnf-α表達都被不同濃度的6-姜烯酚影響， 其中10 μmol/L組和80 μmol/L組的il-6表達量顯著上調(P<0.05),而tnf-α表達隨6-姜烯酚濃度升高而升高，在40 μmol/L達到高峰(P<0.05)。6-姜烯酚顯著抑制了抗炎因子il-10的表達(P<0.05)。

由圖7、8可見，6-姜烯酚顯著下調肝臟細胞中keap1的表達(P<0.05)，上調ho-1的表達(P<0.05)。nrf2表達在20 μmol/L 6-姜烯酚濃度組中顯著上調(P<0.05),40、80 μmol/L濃度組顯著下調(P<0.05)。

3 討 論

本試驗結果顯示6-姜烯酚會抑制斑馬魚肝臟細胞的生長率，且隨著濃度提高，抑制細胞增殖的作用越強，這與6-姜烯酚濃度升高抑制人類原位結腸癌細胞HCT116增殖的研究結果一致[6]。Ishiguro等[19]在6-姜烯酚于人胃癌細胞的研究中，認為6-姜烯酚與微管蛋白中半胱氨酸殘基的 SH 基團的特異性反應，導致微管損傷，細胞在 G2/M 期停滯，因此，筆者猜測這也是降低斑馬魚肝臟細胞的生長率的原因。另外，6-姜烯酚可能通過激活p53和生成ROS導致細胞凋亡和細胞周期阻滯，表現(xiàn)出對人類原代細胞生長的抑制作用[20]，我們得到的結果與其相符。這表明，6-姜烯酚會抑制魚類肝細胞的增殖生長，并隨濃度的增高而抑制作用增強。

圖7 6-姜烯酚孵育后斑馬魚肝臟細胞NF-κB炎癥通路和Keap1-Nrf2/HO-1抗氧化通路中相關基因的表達Fig.7 mRNA expression of the key genes in NF-κB and Keap1-Nrf2/HO-1 pathways in zebrafish liver cells after incubation with different concentrations of 6-shogaol

圖8 6-姜烯酚對Keap1-Nrf2/HO-1抗氧化信號通路的影響機制圖Fig.8 The action mechanism of 6-shogaol on the Keap1-Nrf2/HO-1 antioxidant pathway

氧化應激反應是指在接受到各種有害刺激后，體內產生氧自由基ROS等物質的細胞和組織氧化損傷過程。肝臟是體內的主要代謝器官，當機體長時間受到氧化應激時，大量的氧自由基ROS在肝細胞內蓄積，會損傷細胞物質、影響細胞功能、破壞細胞的結構等，從而引發(fā)多種肝臟疾病[17]。MDA常用于反映細胞和組織的脂質過氧化程度，也是我們判定機體是否氧化應激的重要指標。水生生物高不飽和脂肪酸含量高于哺乳動物，且生活的水生環(huán)境因素變化過大，均會導致體內ROS和MDA含量易升高，易產生氧化應激[21]。本試驗中低濃度的6-姜烯酚可以減少細胞內產生的ROS，但隨著6-姜烯酚濃度的升高，細胞的ROS含量增多。這種情況在抑制子宮內膜癌細胞生長的研究[22]中也同樣出現(xiàn)。由此可見，細胞對6-姜烯酚的濃度有一定的耐受范圍，超過這個范圍，細胞將會產生氧化應激反應。但綜合上述ROS和MDA的試驗結果，我們認為在本試驗濃度范圍內，6-姜烯酚可以促進斑馬魚肝臟細胞的抗氧化作用，同時因為20 μmol/L濃度組的ROS含量最低并且脂質過氧化程度也最低，因此認為20 μmol/L的6-姜烯酚能夠更好地促進斑馬魚肝臟細胞的抗氧化作用。

SOD、GSH-PX、CAT都是體內重要的酶促體系成員。SOD是氧化防御系統(tǒng)的抗氧化物酶，專一清除超氧陰離子，將體內ROS分解成H2O2，常作為抗氧化和免疫指標來進行監(jiān)測[23]。H2O2極易穿過細胞膜且半衰期較長，是一種重要的ROS，能夠引發(fā)細胞的氧化應激，有報道指出，6-姜烯酚對H2O2誘導的人健康腸上皮細胞NCM460具有抗氧化作用[6]。而H2O2能被CAT和GSH-PX氧化成水，從而防止以烴基自由基的形式存在[24]。有研究表明，6-姜烯酚可以通過調節(jié)經典瞬時受體電位通道5(TRPC5)和瞬時受體電位離子通道A1(TRPA1) 電流來調節(jié)細胞的抗氧化能力[25]。此外，SOD的活性會隨著氧化應激的產生而增加，從而發(fā)揮細胞的抗氧化作用[26]。本試驗中6-姜烯酚孵育的斑馬魚肝臟細胞的SOD活性顯著升高，與ROS熒光值水平成負相關，說明6-姜烯酚可以通過增強抗氧化物酶SOD的活性，使肝細胞內ROS含量降低而發(fā)揮抗氧化作用。本試驗中GSH-PX活性和MDA含量也呈負相關，表明6-姜烯酚可提高GSH-PX的活力以減輕細胞的脂質過氧化程度從而發(fā)揮其抗氧化作用。CAT在6-姜烯酚的孵育下活性提高，但和SOD并不表現(xiàn)出同步性，因為兩者在功能上具有相對的獨立性，黃周英等[27]和Yang等[28]的研究中也觀察到類似狀況。80 μmol/L處理組的GSH-PX和CAT酶活顯著升高，細胞的脂質過氧化程度也因此顯著降低，由此可知6-姜烯酚對細胞抗氧化系統(tǒng)具有綜合的影響作用。

Keap1-Nrf2/Are信號通路是氧化應激的重要通路。當有外源物刺激時，Keap1半胱氨酸殘基還原狀態(tài)可能發(fā)生改變，導致Nrf2易位[29]。Nrf2是重要抗氧化因子，Nrf2與Keap1解離后進入細胞核與氧化反應元件結合，調控HO-1、SOD、GSH-PX等抗氧化酶基因表達[30]。HO-1是一種重要的抗氧化酶，其副產物和還原產物具有抵御過氧化物、超氧化物自由基和清除ROS活性的作用[31]。有研究報道，6-姜烯酚通過誘導Nrf2和HO-1來增強抗氧化防御機制[32]。在本試驗中，經過6-姜烯酚處理的斑馬魚肝臟細胞中keap1顯著下調，nrf2在20 μmol/L 6-姜烯酚濃度組顯著上調，ho-1顯著上調，結合上述酶活和ROS含量受到6-姜烯酚影響的試驗結果，說明20 μmol/L的6-姜烯酚能夠顯著促進Keap1與Nrf2解離，抑制keap1基因的表達，促進Nrf2的核轉位，在轉錄水平上激活Nrf2/HO-1信號通路，促進SOD、GSH-PX等活性增強，從而發(fā)揮其抗氧化作用。在本試驗40 μmol/L濃度組中，斑馬魚肝細胞nrf2基因的表達量受到抑制，SOD、GSH-PX活性相比于其他濃度組下降，而ROS含量也隨之上升，這一系列的數(shù)據清晰表明了6-姜烯酚對Nrf2、GSH-PX、SOD和ROS的調控作用。

NF-κB信號通路存在于各類型的細胞中，與腫瘤、炎癥、免疫等生理功能密切相關。NF-κB通路的激活對于細胞免疫因子的表達有重要作用。有研究表明[33]，NF-κB信號通路在脂多糖的處理下活化，炎癥因子表達量上調，導致草魚頭腎白細胞的炎癥反應加劇。激活NF-κB磷酸化p65亞基，使TNF-α、IL-1β、COX-2等炎癥因子釋放，細胞的增殖和修復過程被激活，但過度活化會導致炎癥反應[34]。先前有學者研究過6-姜烯酚對于癌癥細胞或者經過LPS等物質刺激的細胞的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚可通過抑制IκBα磷酸化和蛋白酶降解從而導致p65核轉移的遲緩，隨后抑制NF-κB轉錄活動，抑制細胞增殖和轉移[35]。從本試驗結果來看，6-姜烯酚對斑馬魚肝臟細胞NF-κB信號通路具有激活作用，促進了炎癥因子的表達以及抑制了抗炎因子il-10的表達，該結果與上述人類中的研究結果存在不一致的地方。

綜上所述，我們證實了6-姜烯酚具有顯著的抗氧化作用，而高濃度6-姜烯酚能夠抑制細胞生長，同時我們推測高濃度的6-姜烯酚會造成氧化應激。而6-姜烯酚的抗氧化作用通過抑制keap1基因的表達，解離Nrf2進行核轉位，從而激活Nrf2/HO-1信號通路，提高SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶的活性，降低斑馬魚肝臟細胞的ROS水平和MDA含量從而增強肝細胞的抗氧化機制；同時，6-姜烯酚會使斑馬魚肝臟細胞炎癥因子表達量上調，抗炎因子下調，存在一定的炎癥促發(fā)潛力。