異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌氮代謝機(jī)理的研究進(jìn)展

趙天濤，陳沛沛，張 晟，封 麗

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院， 重慶 400014)

水中含氮化合物超標(biāo)會促進(jìn)藻類等浮游生物的過度繁殖，引起水體富營養(yǎng)化，導(dǎo)致水質(zhì)惡化，對生態(tài)環(huán)境以及人體健康造成嚴(yán)重威脅[1]。相比于物化法，生物脫氮由于經(jīng)濟(jì)、高效、無二次污染等特點(diǎn)，被公認(rèn)為是最有前途的脫氮方法[2]。傳統(tǒng)生物脫氮過程中，氨氮首先被自養(yǎng)硝化菌在好氧條件下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，然后由異養(yǎng)反硝化菌在厭氧或兼氧條件下將硝態(tài)氮還原為含氮?dú)怏w[3]。但是由于不同脫氮菌群的生理機(jī)制差異，導(dǎo)致硝化和反硝化過程在空間和時(shí)間上無法統(tǒng)一，造成系統(tǒng)水力停留時(shí)間長、抗沖擊負(fù)荷能力弱以及運(yùn)行成本高等問題[4]。因此，開發(fā)新型生物脫氮工藝一直是廢水處理領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

1983年，Robertson等[5]首次從廢水中發(fā)現(xiàn)了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化(HN-AD)菌Paracoccuspantotrophus，并提出了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的概念。此后，研究者開展了大量HN-AD菌的分離鑒定工作，截至目前，約有20個(gè)屬近100多種HN-AD菌從環(huán)境中被分離出來[6]，如Acinetobactersp.SYF26[7]，PseudomonasmendocinaX49[8]，BacilluscereusGS-5[9]，AlcaligenesfaecalisWT14[10]，AnoxybacilluscontaminansHA[11]等。這類細(xì)菌在好氧條件下，可以快速將氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w，且氨氮代謝過程中幾乎沒有硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的積累[12]。較傳統(tǒng)脫氮微生物，HN-AD菌具有脫氮速率快、世代周期短等優(yōu)勢，在實(shí)際廢水處理中可以簡化工藝流程，縮短水力停留時(shí)間，降低運(yùn)行能耗。此外，基于HN-AD菌研發(fā)的生物膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)污泥近零排放，碳排放顯著降低[13]。

目前關(guān)于HN-AD菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、脫氮影響因素和關(guān)鍵酶分析等方面，相關(guān)的綜述也多是上述研究的概括與分析，而HN-AD菌具體的脫氮機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)、清晰的認(rèn)識和總結(jié)[14-16]。據(jù)此，對HN-AD菌相關(guān)研究開展了廣泛調(diào)研，并結(jié)合本課題組在HN-AD菌脫氮機(jī)理以及工藝方面的研究，從氮平衡角度對脫氮途徑進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，同時(shí)總結(jié)了HN-AD菌氮代謝作用相關(guān)酶系，對未來HN-AD菌的應(yīng)用提出了展望，以期為此類菌脫氮機(jī)制的研究及在實(shí)際廢水處理中的應(yīng)用提供參考。

1 HN-AD菌氮代謝途徑研究

HN-AD菌可以利用氨氮、亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮為氮源，通過同化作用(assimilation)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞有機(jī)氮；也可以通過異化作用(dissimilation)將氮素轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w(NO、N2O或N2)[17]。本文根據(jù)不同的氮源類型，對HN-AD菌的氮代謝途徑進(jìn)行了總結(jié)。

1.1 HN-AD菌的氨氮代謝途徑

傳統(tǒng)的硝化細(xì)菌為自養(yǎng)型細(xì)菌，在硝化反應(yīng)過程中有機(jī)物濃度不宜過高，否則會使異養(yǎng)細(xì)菌快速增殖，硝化細(xì)菌無法成為優(yōu)勢菌屬，硝化反應(yīng)無法進(jìn)行[23]。而HN-AD菌的好氧同化過程可同時(shí)去除廢水中的有機(jī)物和氨氮。如陳均利等[24]在利用AlcaligenesfaecalisWT14處理實(shí)際養(yǎng)豬廢水時(shí)氨氮、硝態(tài)氮、總氮、COD平均去除率均在90%以上。譚俊杰等[25]發(fā)現(xiàn)菌株GNR在豬場廢水處理中，單位生物量COD和氨氮去除量最高可達(dá)129.73 mg/(L·g)。傳統(tǒng)硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌生理機(jī)制的巨大差異使污水處理系統(tǒng)中本有的有機(jī)物無法被充分利用。如果硝化在前，反硝化過程中需要外加碳源；如果反硝化工藝段前置，則需要大規(guī)?；亓飨趸瘡U水，這些均不利于傳統(tǒng)生物脫氮工藝的高效運(yùn)行[23]。HN-AD菌能夠解決這一難題，可以為一些高濃度有機(jī)廢水的脫氮除碳處理提供新思路和新菌源。

表1 不同HN-AD菌脫氮過程的氮平衡分析結(jié)果

1.2 HN-AD菌的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮代謝途徑

表2 不同HN-AD菌脫氮過程的氮平衡分析結(jié)果

1.3 不同生物脫氮工藝氮代謝途徑比較

圖1 不同生物脫氮工藝的氮代謝途徑示意圖

2 HN-AD菌氮代謝作用酶系

HN-AD菌種屬多樣，在不同菌株中，氮代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)存在較大差異，這也是造成氮代謝途徑有所不同的原因。參照傳統(tǒng)脫氮微生物并根據(jù)HN-AD菌的氮代謝產(chǎn)物可以推測，菌株氮代謝過程中可能涉及的酶有氨同化酶、氨單加氧酶、羥胺氧化酶、硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶[42]。

2.1 氨同化酶

氨同化的關(guān)鍵酶包括谷氨酸脫氫酶(glutamate dehy drogenase，GDH)、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase，AlaDH)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)等[43]。谷氨酸脫氫酶分布廣泛，近年來許多關(guān)于谷氨酸脫氫酶的研究已經(jīng)證明其主要以六聚體和四聚體2種形式存在。谷氨酸脫氫酶是谷氨酸合成的關(guān)鍵酶，也是HN-AD菌發(fā)揮同化作用的關(guān)鍵酶之一，在菌株ArthrobacterureafaciensCZ31[44]，Klebsiellasp.KSND[45]的氮代謝途徑中，都發(fā)現(xiàn)有谷氨酸脫氫酶的活躍作用。丙氨酸脫氫酶能夠催化丙氨酸與丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，與氨基酸代謝和糖代謝有關(guān)，在維持生物體內(nèi)氮平衡(固氮作用)中起重要作用[46]。谷氨酰胺合成酶是生物體中最古老、存在最廣泛的酶，可催化L-谷氨酸與L-谷氨酰胺的相互轉(zhuǎn)化，參與許多生物體的氮代謝和碳代謝[47]。

2.2 氨單加氧酶(AMO)

2.3 羥胺氧化酶(HAO)

2.4 硝酸鹽還原酶

2.5 亞硝酸鹽還原酶

2.6 NO還原酶及N2O還原酶

NO還原酶(NOR)可催化NO還原為N2O，在HN-AD菌中已有較多報(bào)導(dǎo)，如ExiguobacteriummexicanumSND-01[34]，BacillusthuringiensisWXN-23[58]等。NOR活性較強(qiáng)，使得NO一般不容易在系統(tǒng)中積累，避免了NO對微生物的毒性影響[59]。N2O還原酶(NOS)可以將N2O還原為N2。大多數(shù)HN-AD菌中分離得到的NOS都是可溶性的周質(zhì)酶。如菌株P(guān)seudomonas的NOS是由nosZ編碼的亞基組成的二聚體[60]。值得注意的是，N2O還原酶對氧氣敏感，控制適宜的溶解氧對N2O的還原至關(guān)重要[61]。

3 HN-AD菌氮代謝機(jī)理組學(xué)研究

HN-AD菌表現(xiàn)出的脫氮潛力和獨(dú)特代謝機(jī)制吸引了越來越多學(xué)者對這類微生物的關(guān)注。目前，組學(xué)技術(shù)正在成為研究生物體內(nèi)分子的綜合方法[62]，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。應(yīng)用組學(xué)技術(shù)可以從多個(gè)層次闡明HN-AD菌的氮代謝機(jī)理。例如，在以往的研究中，Peng Jin等[45]通過基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)與HN-AD菌氮同化和異化途徑有關(guān)的基因，并利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證分析了不同氮源下基因的變化水平。Ruan等[63]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了高、低不同硝酸鹽濃度下napA、nirS、norB、nosZ等反硝化基因表達(dá)的差異。碳源在好氧反硝化中起著重要作用，利用代謝組學(xué)可以分析不同碳源條件下好氧反硝化過程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的變化[64]。據(jù)報(bào)道，鐵的添加可以增強(qiáng)HN-AD菌的脫氮性能[65]。然而目前鐵引發(fā)的機(jī)理尚不清楚，故Yang等[66]提出可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)來闡明鐵是否通過幫助合成某些反硝化酶的活性中心來促進(jìn)好氧反硝化。

圖2 菌株TAC-1的氮代謝機(jī)制示意圖

4 結(jié)論

上述工藝研究在一定程度上豐富了HN-AD菌的研究范圍，但由于HN-AD菌的種類繁多，脫氮過程的酶系及其編碼基因存在差異，導(dǎo)致HN-AD菌脫氮途徑和機(jī)制尚不清晰，未來還需要更深入的研究和拓展，可以從以下4個(gè)方面進(jìn)行：① 選擇模式菌株，全面深入地解析不同HN-AD菌屬的特征酶以及功能基因，通過酶的活性測定、分離純化、體外表達(dá)以及功能基因敲除等方法，推測HN-AD菌同步脫氮的途徑和機(jī)理；② 考察環(huán)境因子對HN-AD菌的影響，明晰菌體胞內(nèi)生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)或響應(yīng)面分析法尋找最優(yōu)水平組合和工藝參數(shù)；③ 充分利用新一代高通量測序技術(shù)，如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)測序?qū)N-AD菌進(jìn)行分析，研究HN-AD菌基因表達(dá)水平和各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物，從分子水平上推測其脫氮途徑及機(jī)制；④ 研究HN-AD菌在各類真實(shí)廢水中的作用，分析此類菌在氮循環(huán)過程中的地位以及如何優(yōu)化工藝和條件參數(shù)使其成為優(yōu)勢脫氮菌，加強(qiáng)HN-AD菌的實(shí)際應(yīng)用研究。