青藤堿治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果及對MyD88依賴性信號通路的影響

湯文通，洪盛威，孫廣瀚，汪 悅

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是臨床常見的自身免疫性疾病，多發(fā)于中老年人群，主要表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥，隨著疾病進(jìn)展，可發(fā)生骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞，并引發(fā)骨質(zhì)疏松等，最終導(dǎo)致進(jìn)行性、多變性關(guān)節(jié)功能障礙[1]。臨床以手術(shù)、藥物治療為主，可一定程度控制疾病進(jìn)展，改善關(guān)節(jié)功能，但病情易反復(fù)，治愈難度較大[2]。目前，尚無根治RA的方法，主要以藥物緩解關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)和延緩病情進(jìn)展，但部分患者對治療藥物的敏感性不高[3]。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療RA已成為趨勢且取得了初步成效。青藤堿是中藥青風(fēng)藤中特有的生物堿成分，具有免疫抑制、抗炎等藥理作用，現(xiàn)已用于RA治療，但其治療機制尚未完全揭示[4]。髓樣分化因子88(MyD88)依賴性信號通路是參與機體固有免疫和炎癥反應(yīng)的一種重要信號通路，具有調(diào)控炎性因子生成和釋放的作用，而炎癥反應(yīng)作為RA的重要病理改變，提示該信號通路可能參與RA的發(fā)生發(fā)展[5]。中醫(yī)認(rèn)為RA屬于“尪痹”范疇，且臨床常用的糖皮質(zhì)激素有“壯火”之效，久用必導(dǎo)致患者火旺耗氣傷陰，故大多患者常出現(xiàn)虛煩多夢、自汗盜汗、乏力氣短、手足心熱等氣陰兩虛證表現(xiàn)[6]。本研究觀察青藤堿治療氣陰兩虛型RA的臨床效果，并對其作用機制以及與MyD88依賴性信號通路之間的關(guān)系進(jìn)行探討，以期為臨床應(yīng)用提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4—12月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院收治的88例氣陰兩虛型RA為研究對象。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會2009年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；均符合《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》中氣陰兩虛型RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，主癥為關(guān)節(jié)腫大、肌肉酸痛、氣短乏力及口干眼澀；且具備良好理解能力。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并強直性脊柱炎、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎及其他自身免疫性疾??；有消化道出血、消化性潰瘍、大便隱血陽性病史；妊娠或哺乳期女性；嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；有重度高血壓、嚴(yán)重糖尿病、心腦血管疾病等合并癥。根據(jù)治療方法不同將患者分為觀察組和對照組，每組44例。觀察組男22例，女22例；年齡(50.62±4.37)歲；病程(6.04±0.55)年；體質(zhì)量指數(shù)(23.52±2.25)kg/m2。對照組男18例，女26例；年齡(51.12±4.21)歲；病程(5.85±0.63)年；體質(zhì)量指數(shù)(24.05±2.17)kg/m2。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2治療方法 對照組給予雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z52020369)1～1.5 mg/(kg·d)餐后口服，3/d，同時給予甲氨蝶呤片(上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020644)10 mg口服，每周1次。觀察組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺魯銀藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H37023717)20 mg口服，3/d。1個月為1個療程，兩組均治療3個療程。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1主要觀察指標(biāo)：比較兩組治療前及治療3個月后歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟干燥綜合征患者報告指數(shù)(ESSPRI)評分、歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟干燥綜合征疾病活動指數(shù)(ESSDAI)評分。治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，靜置1 h，離心取血清保存于-80 ℃冰箱待測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IgG水平。

1.3.2疼痛及臨床癥狀改善情況：比較兩組疼痛視覺模擬量表(VAS)評分[9]及臨床癥狀改善情況，分別于治療前及治療1、2、3個月后采用VAS評分評價疼痛程度，VAS評分越高則疼痛程度越劇烈；分別于治療前及治療3個月后觀察腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)，以及壓痛、腫脹等癥狀評分，其中壓痛評分分為3分(劇痛)、2分(壓痛)、1分(輕痛)、0分(無痛)，腫脹評分分為2分(重度)、1分(輕度)、0分(無腫脹)。

1.3.3炎性因子：治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，靜置1 h，離心取血清保存于-80 ℃冰箱待測。使用TECAN15018型酶聯(lián)免疫光譜分析儀(Tecan Schneiz A)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細(xì)胞介素-17(IL-17)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.3.4MyD88依賴性信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)：治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，EDTA抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液處理獲取外周血單核細(xì)胞，用Trizol裂解液裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中，加入氯仿后震蕩混勻，室溫下靜置3 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min，取出上清液，加入等體積的異丙醇溶液混勻后，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，去除上清，加入70%乙醇1 ml，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，吸取上清，加入50 μl無RNase水，保存于-70 ℃冰箱待測。取5 μl樣品溶液于Buffer中，在260 nm和280 nm波長處測定吸光度值，計算RNA濃度。以5 μl樣品溶液總RNA為模板，按TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)說明書的要求將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SimpliAmp PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測MyD88、Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)mRNA相對表達(dá)量(2-ΔΔCt法)，其中ΔCt=Ct目標(biāo)mRNA-CtGAPDH。MyD88引物序列上游：5'-GAGATCCGCGAGTTTGAGAC-3'，下游：5'-TYGTCTGTGGGACACTGCTC-3'；TLR4引物序列上游：5'-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3'，下游：5'-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3'；NF-κB引物序列上游：5'-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3'，下游：5'-CTTCTCTCCCCAGGAATA-3'；GAPDH引物序列上游：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'；引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。

1.3.5不良反應(yīng)：觀察并比較兩組治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1主要觀察指標(biāo)比較 治療后，兩組ESSPRI評分、ESSDAI評分、IgG水平均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 不同方法治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩組主要觀察指標(biāo)比較

2.2臨床癥狀改善情況及VAS評分比較 治療后，兩組腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛評分、腫脹評分均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表2。治療1、2、3個月后，兩組VAS評分較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表3。

表2 不同方法治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩組臨床癥狀改善情況比較

表3 不同方法治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩組視覺模擬量表評分比較分)

2.3TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 治療后，兩組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 不同方法治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

2.4炎性因子水平比較 治療后，兩組血清IL-6、IL-17、TNF-α、CRP水平較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 不同方法治療氣陰兩虛型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩組炎性因子水平比較

2.5不良反應(yīng)比較 觀察組出現(xiàn)呼吸道感染、頭痛、口腔潰瘍各2例，紅斑皮疹、惡心嘔吐各1例；不良反應(yīng)發(fā)生率為18.18%。對照組出現(xiàn)惡心嘔吐2例，呼吸道感染、頭痛、口腔潰瘍各1例；不良反應(yīng)發(fā)生率為11.36%。兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組發(fā)生的不良反應(yīng)均癥狀較輕，停藥后自行緩解，故未采取治療措施。

3 討論

RA作為一種臨床常見的自身免疫性疾病，具有較高的致殘、致畸率，主要臨床癥狀包括關(guān)節(jié)壓痛、腫脹，對患者的生活和工作造成嚴(yán)重影響。目前，RA主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及新型生物制劑治療；上述藥物雖有一定療效，但不良反應(yīng)也較明顯，導(dǎo)致患者難以堅持長期用藥[1]。中醫(yī)辨證治療RA已取得一定效果，特別是對于病程較長的氣陰兩虛型RA，中醫(yī)藥對改善氣陰兩虛癥狀療效明顯，同時對RA證候進(jìn)行準(zhǔn)確分型，待確定證素后進(jìn)行針對性的合理用藥，可達(dá)到較佳的療效。臨床藥理研究證實，青藤堿具有改善機體炎癥反應(yīng)，降低炎性因子分泌和表達(dá)的作用，還具有一定的免疫抑制功效[10]。因此本研究應(yīng)用青藤堿治療氣陰兩虛型RA，并分析其起效機制。

本研究結(jié)果顯示，治療后，兩組的主要觀察指標(biāo)、臨床癥狀指標(biāo)均明顯改善，其中觀察組改善情況明顯優(yōu)于對照組，表明青藤堿可顯著改善氣陰兩虛型RA患者的臨床癥狀，提高治療效果。從中醫(yī)角度分析，RA的病機在于濕、寒、熱、風(fēng)等邪氣滯留肢體關(guān)節(jié)、筋脈、肌肉，引起經(jīng)絡(luò)痹阻，其中對于氣陰兩虛型RA的治療在于養(yǎng)陰益氣、通絡(luò)止痛[11]。青藤堿是從青風(fēng)藤中提取的活性成分，青風(fēng)藤藥性辛、苦、平，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)的功效，對風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫脹等具有良好的治療作用，且青藤堿相關(guān)制劑已被用于RA的治療[12]。另外，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，青藤堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理活性，如青藤堿可抑制RA患者滑膜成纖維細(xì)胞分泌炎性因子，進(jìn)而抑制炎性因子對趨化因子的誘導(dǎo)，還能抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化，改善關(guān)節(jié)炎癥，減輕炎癥反應(yīng)對關(guān)節(jié)組織的損傷并消除腫脹[13]。另外，青藤堿可抑制RA患者樹突狀細(xì)胞表達(dá)TLRs，進(jìn)而阻斷TLRs信號通路介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟、分化及炎性因子分泌，通過間接抑制T淋巴細(xì)胞活化而減輕炎癥反應(yīng)[14]，從而發(fā)揮治療作用。

MyD88依賴性信號通路與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該通路主要通過調(diào)控炎性因子的生成、釋放而影響疾病進(jìn)展。LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MyD88依賴性信號通路的過度活化可有效促進(jìn)抑炎因子的生成，抑制促炎因子的分泌，從而減輕RA患者的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，治療后，兩組MyD88依賴性信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)均明顯降低，且觀察組低于對照組，表明青藤堿可有效抑制MyD88依賴性信號通路，從而減輕關(guān)節(jié)炎性損傷，改善RA引起的關(guān)節(jié)僵硬、腫脹、疼痛等臨床癥狀，提高治療效果。體外細(xì)胞實驗證實，青藤堿可抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞內(nèi)MyD88蛋白及基因的表達(dá)，從而延緩成纖維樣滑膜細(xì)胞增生，防止軟骨及軟骨下骨破壞造成的關(guān)節(jié)畸形、強直，同時青藤堿還可抑制滑膜巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞合成TNF-α，從而阻斷RA滑膜炎的發(fā)展[16-17]。錢鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以抑制RA患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)，改善炎性損傷和臨床癥狀，同時抑制血清類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體的表達(dá)，從而發(fā)揮免疫抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果可進(jìn)一步證實青藤堿通過改善機體炎癥反應(yīng)、調(diào)控免疫功能，從而緩解關(guān)節(jié)疼痛、僵直、腫脹及骨破壞，提高治療效果。

綜上所述，青藤堿治療氣陰兩虛型RA的臨床效果顯著，可抑制MyD88依賴性信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等臨床癥狀，安全性良好。