藥用植物內(nèi)生真菌的分離及拮抗菌的篩選與鑒定

王占斌，周 暄，馬鑫博，王靖琳

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

0 引言

簡便高效的各類農(nóng)藥越來越多地應(yīng)用于農(nóng)林植物的生產(chǎn)防治中，但是由于對環(huán)境的破壞與植物病原菌抗藥性的出現(xiàn)，人們不得不尋找其他可替代的、毒副作用小、安全有效的防治手段來防治植物病害，例如生物防治手段，而內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)為人們提供了嶄新的研究方向[1]。植物內(nèi)生菌（endophyte、endophytic fungal或fungal endophyte）是植物病害生物防治的一種天然資源真菌[2]，不僅具有廣泛的理論研究價值和應(yīng)用前景，也影響著植物的生長發(fā)育[3]。Gopane認(rèn)為大多數(shù)藥用植物具有抗菌活性，并寄生了大量的內(nèi)生真菌，用于防御病原體的攻擊，并且這一發(fā)現(xiàn)掀起了植物內(nèi)生菌研究的熱潮[4]。但至今內(nèi)生真菌的概念仍有爭議，人們普遍認(rèn)為植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌[5-6]，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生[7]。近些年來國內(nèi)外對于內(nèi)生菌的分離鑒定及拮抗作用的研究也在逐漸增加，VanAnh Ngo等[8]從越南中部高地黑胡椒(Pipernigrum)90個樣本中分離到了352株內(nèi)生菌株，對其進(jìn)行抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)47株菌株對疫霉菌具有拮抗作用，通過16SRNA基因測序、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定的6種內(nèi)生細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬。Nguyen等[9]從越南中部高地的黑胡椒的根中篩選出4個內(nèi)生菌株，發(fā)現(xiàn)它們對土壤肥力有明顯的改善作用。李永麗等[10]采用稀釋分離法和組織分離法從新疆野蘋果枝干中分離出內(nèi)生菌株，通過平板對峙試驗篩選出顯著抑菌效果的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鑒定M-m7等菌株為芽孢桿菌，接種試驗證明這些生防菌株對蘋果枝條不具致病性。Qian等[11]從番荔枝健康葉和樹皮中分離出具有明顯抗菌活性的內(nèi)生真菌。Nischitha等[12]采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽提取物瓊脂(MEA)和濕潤吸盤法研究了雙角洋芋(Digitaria bicornis)和黃擬蘭(Papalidium flavidum)內(nèi)生真菌的發(fā)生情況。Khiralla[13]從蘇丹藥用植物苦杏仁(Vernonia amygdalina)中分離得到一種內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為曲孢菌(Curvularia papendorfii)。Li等[14]通過真菌菌落形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，認(rèn)為薏苡仁內(nèi)生真菌為青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)和鐮刀菌(Fusarium)。內(nèi)生真菌是植物病害生防菌株的重要來源，其主要抑菌機(jī)制有產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)競爭作用、重寄生作用及抗生作用[15]，內(nèi)生真菌的拮抗作用對于植物病害的防治研究有著一定的價值。而楊樹是一種分布廣泛且適應(yīng)性較強(qiáng)的物種，其主要在北半球溫帶、寒溫帶等區(qū)域分布，不僅可以起到防沙固土與改善環(huán)境的作用，而且其木材也是制造纖維板、刨花板、細(xì)木工板以及造紙紙漿的優(yōu)良材料，因此楊樹具有很高的社會、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。但是楊樹也是一種病害發(fā)生較多的樹種，其中楊樹葉枯病是一項主要病害。楊樹葉枯病病斑可危害毛白楊、小葉楊、小青楊、銀白楊、北京楊等多種楊樹，對楊樹苗木及幼林造成嚴(yán)重危害[16]，是近年來引起人們重視的病害。黃毅[17]研究了楊樹葉棲真菌的群落結(jié)構(gòu)，并利用所分離到得真菌篩選出了具有生防價值的拮抗菌株。筆者研究6種藥用植物的內(nèi)生真菌對楊葉枯病的拮抗作用，以期篩選出有價值的生防內(nèi)生拮抗真菌，從而提高對楊樹葉枯病的綜合防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥用植物 2009年7月在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場采集健康的藥用植物連錢草(Glechoma longituba)、小 白 酒 草 (Conyza canadensis)、毛 茛(Ranunculus japonicus)、土三七(Gynura segetum)、唐松草(Thalictrum aquilegifolium)、白屈菜(Chelidonium majus)。

1.1.2 病原菌 楊葉枯病(Alternaria alternate)病原菌0918在發(fā)病楊樹苗木上分離獲得。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)包含馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂10～12 g，水1000 mL。先將馬鈴薯洗凈去皮稱取200 g，切成塊，置于沸水鍋中煮20～30 min，然后用紗布過濾澄清液，再向澄清液中加入稱量好的葡萄糖和瓊脂，不斷攪拌，全部溶解后補(bǔ)足所蒸發(fā)的水分至1000 mL，分裝，置于滅菌鍋中121℃滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 在無菌條件下，將健康植株的葉片與莖段分別切成1 cm×1 cm的小塊，置于75%的酒精中消毒5 min，無菌水沖洗后2～3次，再置于0.1%的升汞中漂洗10～30 s，無菌水沖洗4～5次，用濾紙吸取多余的水分后置于馬鈴薯固體平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)一段時間后周圍長出少量菌絲。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和生長時間的差異，分別接種到固體平板上培養(yǎng)，長出新的菌落后再挑取其尖端菌絲培養(yǎng)，如此反復(fù)純化多次后即可得到一個純菌株。為了檢查材料表面消毒的效果，將上述同樣表面消毒的一部分不做剪切，直接放置于PDA平板上作對照處理。結(jié)果對照材料周圍均無任何菌落長出，證明表面消毒徹底，從而保證所得到的真菌是植物的內(nèi)生真菌而不是空氣中的或組織塊表面附生的微生物[18]。

1.2.2 內(nèi)生拮抗菌菌株抗菌活性的測定 采用平板對峙法測定拮抗菌株對楊樹葉枯病原菌的拮抗作用。用直徑為5 mm的打孔器分別在培養(yǎng)好的病原菌的菌落邊緣取菌塊，并接種到PDA平板中，然后把拮抗菌接種到距離病原菌一定距離的點上，每個處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，對峙培養(yǎng)7天左右出現(xiàn)不同程度的抑菌圈，觀察菌落的生長情況，定期測量并記錄菌落生長直徑的大小，計算抑菌率[19-20]，如式(1)。

1.2.3 內(nèi)生拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定 為進(jìn)一步鑒定試驗分離得到的拮抗菌菌株，將部分內(nèi)生真菌(MY1、TJ2、BY1)擴(kuò)大培養(yǎng)提取DNA，利用真菌通用引物ITS1、ITS4對其rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，由上海生工生物工程有限公司將PCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測序，并通過BLAST序列對比找到相似序列，最后通過MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建并進(jìn)行種類鑒定。進(jìn)化樹所利用的同源性分析參考用序列的信息如表1。

表1 同源性分析參考用序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用植物內(nèi)生真菌的分離

6種藥用植物的莖與葉共分離得到16種內(nèi)生真菌，其中連錢草5株、小白酒草2株、毛茛4株、土三七2株、唐松草1株、白屈菜2株，將其編號，菌落生長情況如表2。

表2 藥用植物內(nèi)生真菌的分離

2.2 內(nèi)生菌抑制楊葉枯病的測定分析

采用平板對峙法測定16種內(nèi)生真菌與楊樹葉枯病拮抗作用，發(fā)現(xiàn)不同拮抗菌株對楊樹葉枯病菌絲生長有不同的抑制作用。各內(nèi)生真菌對指示菌的抑制作用測定結(jié)果見表3。按抑菌圈直徑將拮抗菌分為強(qiáng)(＞10 mm)、中(5～10 mm)、弱(＜ 5 mm)3類。

藥用植物內(nèi)生真菌的拮抗機(jī)制有競爭作用、重寄生作用、抗生作用、溶菌作用等，由于其作用機(jī)制不同效果也不同。由表3可知，對楊葉枯病抑制效果較強(qiáng)的有LJ3、MJ2、MY1、TJ1、TJ2、BJ1、BY1，抑制效果中等的有LJ2、MJ1、TSJ1，抑制效果較弱的有LJ1、LY2、XJ1、XY1、MY2。對測試菌的抑制率比較結(jié)果表明，MJ2對楊葉枯病的抑制率最高，可達(dá)56.47%；其次為BYI，抑菌率達(dá)到54.94%。LJI對楊葉枯病沒有明顯的拮抗效果，LY1生長迅速，較短時間內(nèi)即可抑制楊葉枯病的生長，但是沒有抑菌圈，這是由于LY1的生長迅速并且營養(yǎng)吸收較快，導(dǎo)致與楊樹葉枯病病菌形成競爭作用，楊樹葉枯病病原菌的生長被抑制（圖1）。分離得到的楊葉枯病原為半知菌的鏈格孢菌(Alternariaalternate)。分生孢子梗多數(shù)叢生，少數(shù)單生，暗橄欖黃至淡橄欖褐色，有隔，直立或彎曲，分枝或不分枝；分生孢子通常形成鏈，一般由10個或10個以上孢子組成，孢子具縱橫隔（圖2）。觀察菌落發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)靠近生長邊緣的菌絲不能向外擴(kuò)張，利用顯微鏡檢查菌絲體，發(fā)現(xiàn)其生長扭曲且不規(guī)則，菌絲頂端或中間膨大，孢子畸形或表面不光滑。這是由于拮抗菌的抑菌作用導(dǎo)致楊樹葉枯病病原菌生長受到抑制。

表3 藥用植物內(nèi)生真菌拮抗活性

續(xù)表3

圖1 分離拮抗菌對楊樹葉枯病的拮抗效果

圖2 楊葉枯病病原菌孢子

2.3 拮抗菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

（1）經(jīng)測定，土三七內(nèi)生真菌TJ2序列總長為540bp，序列為TGGGGGAGTTTCCGGAGGATCACTCCCAACC CCTGTGACATACCTTAATGTTGCCTCGGCGGATCAGC CCGCGCCCCGTAAAACGGCCCGGCCCGCCAGAGGAC CCAAACTCTAATGTTTCTTATTGTAACTTCTGAGTAA AACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATC TCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTGGTATT CCGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCT CAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCTCTGC CTTCTGGCGGTGCCGCCCCCGAAATACATTGGCGGT CTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTC GCAACTGGAACGCGGCGCGGCCATGCCGTAAAACCC CAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAAT ACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG GAA。經(jīng)分析可知，各堿基數(shù)分別為136A、122T、150C、132G，利用MEGA分析軟件將目標(biāo)序列與GenBank上收錄的相近序列進(jìn)行比對分析并制作系統(tǒng)進(jìn)化樹[21-24]。結(jié)果（圖3）顯示，該菌與GenBank登錄號為MK934343.1的Fusarium tricinctum在同一分支上，同源性大于99%。Landeweert等[25]認(rèn)為，真菌通過ITS區(qū)域比對，序列相似性≥99%，鑒別為相同種；序列相似性＞95%且＜99%，鑒別為相同屬；序列相似性≤95%，鑒別為相同科。因此，土三七內(nèi)生真菌TJ-2鑒定為三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)。

圖3 TJ2系統(tǒng)進(jìn)化樹

（2）經(jīng)測定,毛茛內(nèi)生真菌MY1序列總長為544 bp，序列為GGGGATTCGGAGCTAAACTCCCAACCCATGT GAACATACCTATTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCCG GGCGCCTCGTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAG GAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAG TAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG TATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAA CCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATCGGC CAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAG TGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTG ATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTT AAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCTCAGATCAGG TAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGAA。經(jīng)分析可知，各堿基數(shù)分別為132A、129T、143C、140G，利用MEGA分析軟件將目標(biāo)序列與GenBank上收錄的相近的序列進(jìn)行對比，制作系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4。結(jié)果顯示，該菌與GenBank登錄號為MT447494.1與FJ025201.1的Clonostachys rosea在進(jìn)化樹上同枝，同源性大于99%，與粉紅粘帚霉[26]的其他菌株同源性大于98%～100%，因此將毛茛內(nèi)生真菌MY1確定為Clonostachys rosea的不同菌株。

圖4 MY1系統(tǒng)進(jìn)化樹

（3）經(jīng)測定，白屈菜內(nèi)生真菌BY1序列總長為543bp，序列為GGGGGATCGAGCTAACTCCCAACCCATGT GAACATACCTATTGTTGCTTCGGCGGGATTGCCCCG GGCGCCTCGTGTGCCCCGGATCAGGCGCCCGCCTAG GAAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAG TAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAG TATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAA CCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATCGGC CAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAG TGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTG ATATTCCGCATCGGAGAGCGACGAGCCCCTGCCGTT AAACCCCCAACTTTCCAAGGTTGACCTCAGATCAGG TAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGG CGGAGGAA。經(jīng)分析可知，各堿基數(shù)分別為131A、143C、141G、128T，利用MEGA分析軟件將目標(biāo)序列與GenBank上收錄的相近序列進(jìn)行比對，制作系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5。經(jīng)過比對分析，該菌與GenBank登錄號為KU350706.1的Clonostachys rosea同源性大于99%，僅有2個堿基的差異，與粉紅粘帚霉的其他菌株同源性大于97%～100%。經(jīng)分析，將白屈菜內(nèi)生真菌BY1確定為Clonostachys rosea的不同菌株。

圖5 BY1系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

通過分離純化6種藥用植物連錢草、小白酒草、毛茛、土三七、唐松草、白屈菜的內(nèi)生真菌，獲得對楊樹葉枯病原真菌抑制作用較強(qiáng)拮抗菌株7株，分別為LJ3、MJ2、MY1、TJ1、TJ2、J1、BY1。其中MJ2對楊葉枯病的抑制率最高，可達(dá)56.47%；其次為BYI，抑菌率達(dá)到54.94%。通過顯微觀察與18S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定MY1與BY1為粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)，是目前已發(fā)現(xiàn)的拮抗微生物中極具潛力的生防因子之一；TJ2為鐮孢霉屬(Fusarium)的一個菌株。

4 討論

內(nèi)生真菌廣泛分布在植物中，從植物的葉鞘、種子、花、莖、葉片和根等中都已分離到內(nèi)生真菌[27]。在內(nèi)生真菌的研究中，由于培養(yǎng)基的限制，不能保證所有生活在植物組織中的內(nèi)生真菌都能被分離，有些可能不能在人工培養(yǎng)基上生長，而有些生長緩慢的真菌往往被快速生長的物種覆蓋，這些物種也不能被分離。真菌具有易培養(yǎng)、易控制、生長繁殖迅速、不受季節(jié)、氣候和地域的限制、生產(chǎn)成本低、生長快等優(yōu)點，并可通過誘變育種、細(xì)胞融合基因工程等手段來提高菌種性能，所以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)容易實現(xiàn)，對于植物來源的拮抗菌的開發(fā)具有十分重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益[28]。

目前對于楊樹葉枯病等楊樹病害的防治大多停留在營林措施與化學(xué)防治階段。利用農(nóng)藥防治不但費時費力而且污染環(huán)境，利用有效的生防拮抗菌種會解決許多由于化學(xué)防治帶來的環(huán)境問題，使用得當(dāng)更會省時省力。本研究采用連錢草、小白酒草、毛茛、土三七、唐松草，白屈菜6種藥用植物的健康葉片和莖段進(jìn)行分離篩選出16種內(nèi)生真菌，得到其中對楊葉枯病抑制效果較好的7種內(nèi)生真菌。由于本試驗著重于具有拮抗作用內(nèi)生菌的分離，因此對于篩選出的內(nèi)生真菌有必要在今后試驗中就拮抗的機(jī)制等方面進(jìn)行更為深入的研究。