生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)、生理特性以及土壤微生物功能多樣性的影響

于會(huì)麗，徐變變，徐國(guó)益，邵 微,2，高登濤，司 鵬

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，鄭州 450009；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002）

0 引言

生物有機(jī)肥含有功能菌，功能菌的快速繁殖可優(yōu)化土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤酶活性，活化土壤養(yǎng)分[1]，提高根系活力[2]，促進(jìn)根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用[3]，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]，增強(qiáng)作物抗病和抗逆性[6-7]。如曹亮亮等[8]發(fā)現(xiàn)在腐熟雞糞堆肥中添加2種蛋白原料固態(tài)發(fā)酵根際功能菌研制成的生物有機(jī)肥，均能顯著增加盆栽香蕉植株的株高和假莖粗。陳波等[9]研究表明，生物有機(jī)肥較對(duì)照及有機(jī)肥處理，顯著促進(jìn)了盆栽櫻桃樹(shù)體對(duì)氮、磷、鉀的吸收。艾爾買(mǎi)克·才卡斯木等[10]通過(guò)盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同氯化鈉濃度脅迫下，實(shí)生核桃幼苗接種EM菌，核桃幼苗生物量和超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性均顯著高于非菌根植株，而葉片丙二醛(MAD)含量顯著低于非菌根植株。同時(shí)邵麗等[11]采用Biolog-Eco法研究表明，生物復(fù)混肥能顯著提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落豐富度和功能多樣性。孫薇等[12]利用Biolog-Eco技術(shù)分析了不同施肥處理對(duì)土壤微生物群落代謝能力的影響，結(jié)果表明，生物有機(jī)肥處理土壤微生物活性、物種多樣性、豐富度以及對(duì)6類碳源代謝能力均顯著高于常規(guī)施肥。然而生物有機(jī)肥在促進(jìn)盆栽蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)、抗逆指標(biāo)以及對(duì)土壤微生物多樣性影響的有關(guān)報(bào)道仍較少。

本研究以1年生蘋(píng)果幼苗‘煙富8號(hào)’為試材，以常規(guī)有機(jī)肥雞糞為對(duì)照，研究生物有機(jī)肥不同施用量對(duì)蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)、生理特性以及土壤微生物功能多樣性的影響，確定其在樹(shù)苗栽培中最佳施用量，以期為生物有機(jī)肥在苗木培育中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地基本情況

試驗(yàn)于2017年4月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所試驗(yàn)田進(jìn)行。區(qū)域氣候?yàn)闇貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，年平均降雨量632 mm，無(wú)霜期220天，全年日照時(shí)間約2400 h。

1.2 供試材料

供試作物為1年生蘋(píng)果幼苗‘煙富8號(hào)’。

供試肥料包括生物有機(jī)肥（有效活菌數(shù)≥2億個(gè)/g，有機(jī)質(zhì)≥70%，氨基酸≥20%，腐殖質(zhì)≥40%，N+P2O5+K2O≥6%）和雞糞（有機(jī)質(zhì)≥50%，N+P2O5+K2O≥6%）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以盆栽方式進(jìn)行，采用內(nèi)徑31 cm、高38 cm的圓筒塑料盆，每盆裝風(fēng)干土20 kg。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，CK為雞糞35 g/(kg·土)，T1、T2、T3分別為生物有機(jī)肥23.3、35、70 g/(kg·土)，其中，23.3、35、70 g/(kg·土)指供試肥料中折算出有機(jī)含量與土壤質(zhì)量比值，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)種植4盆，完全隨機(jī)排列。各處理中土壤與有機(jī)肥充分混勻后裝盆備用。

1.4 樣品采集及測(cè)定

1.4.1 株高樣品選擇 9月收獲時(shí)，每處理每重復(fù)選擇生長(zhǎng)一致的‘煙富8號(hào)’蘋(píng)果幼樹(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 葉片樣品采集 9月收獲時(shí)，每株采取枝條倒2～4片葉，一部分葉片帶回實(shí)驗(yàn)室立即測(cè)定鮮重、葉面積、葉片SPAD值，后烘干粉碎用于測(cè)定葉片中氮磷鉀含量；一部分葉片用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室并保存于4℃冰箱中用于測(cè)定葉片抗性物質(zhì)和酶活性等指標(biāo)。

1.4.3 土壤樣品采集 每處理每重復(fù)選擇4株樹(shù)以抖落法[13]采集果樹(shù)根際土壤樣品，去除植物殘根等雜物后，并將4個(gè)土樣混合，過(guò)2 mm孔徑的無(wú)菌篩網(wǎng)，-80℃儲(chǔ)存。

1.4.4 根系樣品采集 將去除土壤的根系放于0.149 mm的篩中，用水沖洗干凈，取出雜物、死根后，將根系用吸水紙吸干后保存，用于測(cè)定根系的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.5 樣品測(cè)定 株高用直尺測(cè)量植株從露出土壤根部至頂端的距離，葉面積采用便攜式葉面積儀CI-203CA測(cè)定，主根長(zhǎng)采用直尺測(cè)定，根體積采用排水法測(cè)定[14]，葉片SPAD值采用SPAD-502儀測(cè)定，葉片可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定[15]，葉片可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[15]，葉片丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定[14]，葉片脯氨酸采用磺基水楊酸法測(cè)定[14]，葉片POD（過(guò)氧化物酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]，采用H2SO4和H2O2消煮，全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（Clever Chem 380，德國(guó)）測(cè)定葉片氮和磷含量，火焰光度計(jì)測(cè)定葉片鉀含量[17]。

1.4.6 土壤微生物群落測(cè)定 將相當(dāng)于1 g烘干土的新鮮土壤加入到盛有99 mL 0.85%滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，28℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min，使土樣與生理鹽水充分混勻，再放置在4℃冰箱內(nèi)靜置30 min，然后加樣于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培養(yǎng)192 h，每24 h Biolog自動(dòng)讀取儀讀數(shù)1次（Biolog MicroStation自動(dòng)微生物鑒定，美國(guó)）。Biolog-ECO 96孔微平板上分布31種單一碳源和空白對(duì)照，每種碳源和空白有3個(gè)平行。31種單一碳源大致可分為6類（碳水化合物、氨基酸類、羧酸類化合物、聚合物、胺類化合物和酚酸類化合物），并以各類碳源在96 h的相對(duì)光密度(Ci-R)平均值表示土壤微生物對(duì)這一碳源的利用強(qiáng)度。一個(gè)板可以測(cè)3個(gè)平行。

微生物群落功能多樣性的計(jì)算[18]如式(1)～(5)。

Mc Intosh指數(shù)(U)是基于群落物種多維空間距離的多樣性指數(shù)，可利用第i孔的相對(duì)吸光值(ni)計(jì)算得到[式(1)]。

Shannon-Wiener指數(shù)(H')用于評(píng)估豐富度，其中Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比例，如式(3)。

式中，Ci為所測(cè)定的31個(gè)碳源孔的吸光值，R為對(duì)照孔的吸光值。

Simpson指數(shù)(D)又稱優(yōu)勢(shì)度指數(shù)，是對(duì)多樣性方面的集中性度量[式(4)]。

Pielou均勻度指數(shù)(E)是群落實(shí)測(cè)多樣性與最大多樣性的比例[式(5)]。

式中，S為豐富度指數(shù)，代表被利用的碳源總數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)整理與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)蘋(píng)果幼苗生物量（株高、葉面積、百葉鮮重、根體積、根長(zhǎng)）、葉片生理特性（丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶、SPAD值、葉片氮、磷、鉀）、土壤微生物群落多樣性指數(shù)（均勻度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均一性指數(shù)）、土壤微生物對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度（聚合物、碳水化合物、酚酸類化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類）用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析。分析中，一般選擇特征值大于1的成分作為主成分。本研究數(shù)據(jù)分析中，特征值大于1的有3個(gè)成分，分別記作F1、F2、F3。這3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為100.00%，表示這3個(gè)主成分涵蓋了所有的原始數(shù)據(jù)信息。每個(gè)處理的綜合得分按照式(6)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果苗生物量的影響

如表1所示，與CK相比，生物有機(jī)肥處理增加蘋(píng)果苗株高和根長(zhǎng)，其中，T1處理的株高和根長(zhǎng)最高，較CK分別顯著增加14.24%和24.02%，且T1處理與其他處理差異顯著。生物有機(jī)肥處理的蘋(píng)果幼苗葉面積和百葉鮮重均低于CK，其中T3處理的葉面積和百葉鮮重最低，較CK分別顯著降低12.78%和23.85%，其他處理與CK差異不顯著。除T1處理外，生物有機(jī)肥處理的蘋(píng)果幼苗根體積均顯著低于CK。

表1 不同處理對(duì)蘋(píng)果幼苗生物量的影響

2.2 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片生理特性的影響

2.2.1 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片抗性物質(zhì)的影響 由表2可以看出，施用不同濃度生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片抗逆性指標(biāo)影響各異。與CK相比，T1處理的蘋(píng)果葉片可溶性糖和脯氨酸含量最高，丙二醛含量最低，除可溶性糖外，差異達(dá)顯著性水平。生物有機(jī)肥處理的蘋(píng)果葉片可溶性蛋白含量均低于CK，其中T1和T3處理葉片可溶性蛋白較CK分別顯著降低19.65%和26.39%。

表2 不同處理對(duì)蘋(píng)果葉片抗性物質(zhì)的影響

2.2.2 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片酶活性和SPAD值的影響 由圖1可知，T1處理下，蘋(píng)果葉片過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性達(dá)最高，較CK分別增加5.84%和5.48%，差異不顯著；與CK相比，T2處理顯著提高蘋(píng)果葉片過(guò)氧化氫酶活性，其他處理與CK無(wú)顯著差異；T3時(shí)處理下，蘋(píng)果葉片過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫和苯丙氨酸解氨酶活性達(dá)最低。由此表明，低用量生物有機(jī)肥可促進(jìn)葉片酶活性，高用量抑制葉片酶活性。蘋(píng)果葉片SPAD值由高到低依次為T(mén)1＞T2＞T3＞CK，其中，T1和T2處理蘋(píng)果葉片SPAD值較CK分別顯著提高15.45%和12.71%，T3處理與CK差異不顯著。

圖1 不同處理對(duì)蘋(píng)果葉片過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫和苯丙氨酸解氨酶活性以及SPAD值的影響

2.2.3 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片氮、磷、鉀含量的影響 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片氮、磷、鉀含量的影響如圖2。結(jié)果表明，T1和T3處理蘋(píng)果葉片氮含量較CK分別增加2.58%和7.79%。同時(shí)生物有機(jī)肥顯著提高蘋(píng)果葉片鉀含量，鉀含量由高到低依次為T(mén)1＞T2＞T3＞CK，T1處理較CK顯著增加27.33%，不同處理間差異不顯著。但生物有機(jī)肥處理對(duì)蘋(píng)果葉片磷含量影響不大。

圖2 不同處理對(duì)蘋(píng)果葉片氮、磷、鉀含量的影響

2.3 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果土壤微生物多樣性的影響

2.3.1 不同處理土壤微生物功能多樣性指數(shù)分析 選取土樣培養(yǎng)96 h數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物代謝多樣性分析，不同施肥處理對(duì)蘋(píng)果土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)影響不同，如表3所示。T2處理的土壤優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D、多樣性指數(shù)H'和豐富度指數(shù)S顯著低于其他處理，T3處理的多樣性指數(shù)H'、豐富度指數(shù)S和均一性指數(shù)U最高，較CK分別提高0.91%、7.60%和4.14%，且與T1處理差異不顯著。

表3 土壤微生物群落多樣性指數(shù)

2.3.2 不同處理土壤微生物對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度 由圖3可知，施生物有機(jī)肥與雞糞CK土壤微生物對(duì)Biolog-Eco板中不同類碳源利用強(qiáng)度存在不同差異。T1處理土壤微生物對(duì)酚酸類化合物和胺類利用強(qiáng)度較CK分別增加18.87%和13.51%，且與其他處理無(wú)顯著性差異；T3處理土壤微生物對(duì)聚合物、碳水化合物、氨基酸類和胺類利用強(qiáng)度最高，較CK分別增加20.00%、6.33%、16.88%和18.92%；與CK相比，T2處理土壤微生物對(duì)聚合物、碳水化合物和羧酸類利用強(qiáng)度分別降低8.33%、8.86%和21.79%。

圖3 不同處理土壤微生物對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度

2.4 不同處理對(duì)蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)、土壤微生物多樣性指數(shù)、碳源利用強(qiáng)度綜合影響主成分分析

通過(guò)主成分分析（表4）可知，第1主成分其特征值的變量解釋度為45.345%，是最主要的解釋變量，前2個(gè)成分的特征值為79.196%，表明這2個(gè)成分是主要分析部分。對(duì)各處理在3個(gè)成分中進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（表5），T1得分最高，為2.06，說(shuō)明T1處理蘋(píng)果土壤微生物功能多樣性指數(shù)、碳源利用強(qiáng)度及蘋(píng)果苗生物量、葉片抗性物質(zhì)、酶活性、SPAD值、養(yǎng)分含量最高。

表4 指標(biāo)總方差分解

表5 不同處理蘋(píng)果幼苗綜合評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

施用生物菌肥可不同程度上增加蘋(píng)果幼苗株高、根長(zhǎng)、葉片鉀養(yǎng)分、可溶性糖和脯氨酸含量，影響葉片酶活性，改善土壤微生物功能多樣性，其中以施用23.3 g/(kg·土)生物有機(jī)肥的效果最好。施用生物有機(jī)肥23.3 g/(kg·土)顯著提高蘋(píng)果苗株高、根長(zhǎng)和葉片鉀養(yǎng)分、脯氨酸和SPAD值，增加葉片酶活性，促進(jìn)蘋(píng)果苗生長(zhǎng)，施用70 g/(kg·土)生物有機(jī)肥反而降低葉片酶的活性；同時(shí)，施用23.3 g/(kg·土)生物有機(jī)肥增加土壤微生物群落豐富度，提高土壤微生物對(duì)酚酸類化合物和胺類利用強(qiáng)度。

4 討論

4.1 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果幼苗生物量和養(yǎng)分含量的影響

生物有機(jī)肥含有溶磷、固氮功能的有益微生物，能夠改善土壤環(huán)境，促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育[19]。李北齊[20]研究發(fā)現(xiàn)，施用生物有機(jī)肥能增加盆栽鹽堿土玉米的株高和根長(zhǎng)。本研究與其類似，施用生物有機(jī)肥均能促進(jìn)蘋(píng)果幼苗的株高和根長(zhǎng)，其中生物有機(jī)肥23.3 g/(kg·土)處理(T1)效果最佳。生物有機(jī)肥用量為70 g/(kg·土)處理(T3)對(duì)蘋(píng)果幼苗葉面積、百葉鮮重以及根體積產(chǎn)生抑制作用?？赡苁怯捎谏镉袡C(jī)肥用量過(guò)多，其成分抑制或?qū)е缕渌毓?yīng)不足，從而抑制蘋(píng)果幼苗生長(zhǎng)[21]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥可提高蘋(píng)果葉片氮和鉀含量，這與張金妹等[22]的研究結(jié)果相似。生物有機(jī)肥中的有益微生物菌群具有固氮解鉀能力，使土壤養(yǎng)分有效地供應(yīng)給作物，從而提高氮、鉀含量[23]。

4.2 生物有機(jī)肥對(duì)蘋(píng)果葉片生理特性的影響

丙二醛是植物在逆境環(huán)境下細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量反映植物遭受逆境的傷害程度[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與雞糞CK相比，施用生物有機(jī)肥能夠顯著降低蘋(píng)果葉片丙二醛含量，即降低蘋(píng)果葉片膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，預(yù)防并修護(hù)葉片細(xì)胞和細(xì)胞膜損傷，增強(qiáng)植株生長(zhǎng)代謝活力，這與劉艷等[25]的研究結(jié)果相似。脯氨酸是植物體內(nèi)一種細(xì)胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在逆境環(huán)境下體內(nèi)脯氨酸含量發(fā)生改變[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥低濃度23.3 g/(kg·土)處理葉片脯氨酸含量顯著高于高濃度70 g/(kg·土)處理，可能是高濃度生物有機(jī)肥脅迫下細(xì)胞受害嚴(yán)重，導(dǎo)致葉片脯氨酸含量減少[26]。植物體內(nèi)防御酶活性與植物抗性相關(guān)，生物有機(jī)肥增強(qiáng)草莓抗逆性[27]。本研究表明，生物有機(jī)肥能提高葉片過(guò)氧化氫酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，增強(qiáng)幼苗抗逆性，這與謝東鋒等[28]研究結(jié)果相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥低濃度23.3 g/(kg·土)處理時(shí)3種酶活性增加，高濃度時(shí)70 g/(kg·土)處理酶活性降低，這可能與處理葉片丙二醛含量有關(guān)（表2），即丙二醛含量降低，酶活性增加，丙二醛含量的積累對(duì)酶活性增加具有誘導(dǎo)作用[29]。

4.3 生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響

筆者用Biolog-Eco方法研究了施用生物有機(jī)肥對(duì)土壤中微生物群落代謝的影響，結(jié)果表明，施用生物有機(jī)肥平均能增加土壤微生物多樣性指數(shù)以及微生物對(duì)6類碳源的利用強(qiáng)度，可能是生物有機(jī)肥的施用改善了土壤水分、營(yíng)養(yǎng)、通氣等環(huán)境條件，為土壤微生物提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，提高了土壤微生物代謝能力，增強(qiáng)了土壤微生物競(jìng)爭(zhēng)能力，從而提高土壤微生物功能多樣性以及對(duì)6類碳源的利用能力[30-31]，具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。