生物信息學(xué)分析在非小細(xì)胞肺癌關(guān)鍵通路和基因鑒定中的應(yīng)用

歐陽慧敏，朱虎全，郭建波，孫 遜，付 強(qiáng)，曹嫦妤，李欣然

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常見的肺癌類型，大多患者在經(jīng)歷外科手術(shù)治療后仍因復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而死亡，近五年NSCLC 患者總體生存率極低急需找到一個(gè)新標(biāo)記，因此，了解其增殖、凋亡及浸潤的分子機(jī)制對于制定更有效的診斷和治療策略極其重要。

用于分析基因表達(dá)的高通量平臺，如基因芯片，越來越被認(rèn)為是具有巨大臨床應(yīng)用前景的醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)工具：從癌癥的分子診斷到分子分型、從患者分層到預(yù)后評估、從新藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)到腫瘤反應(yīng)預(yù)測［1-3］。在過去的十年中，許多關(guān)于NSCLC 致癌作用的基因表達(dá)譜研究都是使用基因芯片技術(shù)進(jìn)行研究，這些研究顯示了數(shù)百個(gè)不同途徑、生物學(xué)過程或分子功能的差異表達(dá)基因（DEGs）?，F(xiàn)今，基因芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析使得可綜合地分析在NSCLC 發(fā)生發(fā)展過程中mRNA的表達(dá)變化。然而，DEGs 間的相互作用，特別是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的途徑，仍有待于闡明。在肺癌中，NSCLC 占大約85%［4］，大多數(shù)NSCLC 患者在手術(shù)切除治療后仍因局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而死亡，5 年生存率不高［5］。因此，了解NSCLC的轉(zhuǎn)移機(jī)制對于靶向治療和預(yù)后至關(guān)重要，為了提高生存率和防治，有必要清楚NSCLC 發(fā)展的病因和機(jī)制。近年來，基因芯片技術(shù)迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于揭示疾病進(jìn)展過程中的遺傳改變，從而確定腫瘤的診斷、治療和預(yù)后的靶點(diǎn)。

筆者從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載了原始數(shù)據(jù)，該系統(tǒng)是存儲庫，可作為基因芯片數(shù)據(jù)存儲和檢索的樞紐。比較NSCLC 患者與健康樣本的基因表達(dá)譜，以確定DEGs 和差異表達(dá)的microRNAs（DEMs）。隨后利用GeneSpring 軟件篩選了DEGs，并進(jìn)行了基因本體論（GO）和關(guān)鍵基因組百科庫（KEGG）通路富集分析。通過分析其生物學(xué)功能和途徑，可以從分子水平進(jìn)一步了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展，并探索潛在的候選生物標(biāo)志物用于診斷、預(yù)后和藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得5 種基因表達(dá)譜（GSE75037、GSE74706、GSE33532、GSE43458、GSE27262）和GSE63805的miRNA 表達(dá)譜，物種選擇人。GSE75037的陣列數(shù)據(jù)包括83 份NSCLC 組織樣本和18 份健康樣本，GSE74706 包括18 份NSCLC 組織樣本和20 份健康樣本，GSE33532 包括80 份NSCLC 組織樣本和20 份健康樣本，GSE43458 包括80 份NSCLC 組織樣本和30 份健康樣本，GSE37362 包含25 份NSCLC組織樣本和25 份健康樣本，GSE63805的miRNA 表達(dá)譜包含32 份NSCLC 組織樣本和30 份健康樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理

GEO 數(shù)據(jù)庫記錄了大量高通量功能基因組研究，這些研究包含使用各種方法處理和標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。應(yīng)用GEO2R（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/geo2r/）篩選NSCLC 與健康樣本之間差異表達(dá)的miRNAs 和基因。GEO2R 使用來自生物導(dǎo)體項(xiàng)目的GEOquery 和limma R 包對原始提交者提供的經(jīng)過處理的數(shù)據(jù)表進(jìn)行比較。adjusted P values（adj.P）用于糾正假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，默認(rèn)情況下使用Benjamini 和Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率方法。The adj.P<0.01 和|logFC|>1 被設(shè)定為最低標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 GO和KEGG途徑富集分析

注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）為研究者提供了一整套功能注釋工具，幫助他們了解大量基因背后的生物學(xué)意義。應(yīng)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對鑒定的DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 途徑富集分析。P<0.01 被設(shè)定為最低標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的集成與模塊分析

蛋白質(zhì)之間的功能相互作用可以為細(xì)胞加工的分子機(jī)制提供背景信息。本研究利用蛋白互作分析工具STRING（http://string-db.org）和數(shù)據(jù)庫檢索工具構(gòu)建了DEGs的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用細(xì)胞掃描技術(shù)（http://www.cytoscape.org/index.html）對其進(jìn)行可視化研究。閾值＞0.4 被設(shè)為最低標(biāo)準(zhǔn)。然后，利用分子復(fù)合檢測技術(shù)（Molecular Complex Detection，MCODE）對PPI 網(wǎng)絡(luò)的模塊進(jìn)行分析，篩選顯著模塊，條件設(shè)置為：degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，K-Core=3 以及Depth from Seed=100。此外，還對模塊中的DEGs 進(jìn)行了KEGG 途徑富集分析。P＜0.01 被設(shè)定為差異極顯著。

1.5 miRNA 靶標(biāo)的預(yù)測

miRWalk2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/miRretsys-self.html）是一款可自由使用的綜合檔案館，以各種新穎和獨(dú)特的功能提供關(guān)于預(yù)測性的和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA 靶標(biāo)相互作用的集合，為miRNA 研究者提供有利幫助。miRWalk2.0 是一個(gè)產(chǎn)生于12 個(gè)已建立的miRNA 靶標(biāo)預(yù)測程序（miRWalk、miRDB、PITA、MicroT4、miRMap、RNA22、miRanda、miRNAMap、RNAhybrid、miRBridge、PICTAR2 和Targetscan）的綜合資源，通過miRanda、Pictar2 和Targetscan 項(xiàng)目預(yù)測的基因被鑒定為miRNAs 靶標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的鑒定

從GSE75037、GSE74706、GSE33532、GSE43458 和GSE27262 數(shù)據(jù)集中分別分離出3 413 個(gè)、5 001 個(gè)、2 793 個(gè)、893 個(gè)和2 255 個(gè)DEGs。在所有5 個(gè)數(shù)據(jù)集中篩選出462 個(gè)基因，如圖1 所示，其中，460 個(gè)基因在5 個(gè)數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出相同的表達(dá)趨勢，與健康肺組織相比較，在NSCLC 組織中包含116 個(gè)上調(diào)基因和344 個(gè)下調(diào)基因。

圖1 mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的鑒定

2.2 功能和通路富集分析

我們上傳了所有DEGs 至軟件DAVID 來識別表達(dá)基因的GO 類型和KEGG 通路。上調(diào)基因主要包含在生物過程相關(guān)的細(xì)胞周期和有絲分裂，而下調(diào)基因主要富集于循環(huán)系統(tǒng)。對于細(xì)胞成分，上調(diào)DEGs 富集于中間體、紡錘體、微管骨架、驅(qū)動蛋白配合物和細(xì)胞外基質(zhì)，下調(diào)DEGs 富集于胞外區(qū)和細(xì)胞外基質(zhì)。此外，GO 分子功能分析還顯示出上調(diào)DEGs 明顯富集于金屬內(nèi)肽酶活性、微管運(yùn)動活性、內(nèi)肽酶活性與運(yùn)動性活動，下調(diào)DEGs 富集于糖胺聚糖結(jié)合、受體結(jié)合、鈣離子結(jié)合、硫化合物結(jié)合、肝素結(jié)合，如表1 所示。而且，4 條KEGG 通路在細(xì)胞周期、p53 信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟和ECM-受體相互作用中過度表達(dá)，下調(diào)DEGs 富集于細(xì)胞粘附因子、瘧疾、PPAR 信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)，如表2 所示。

表1 非小細(xì)胞肺癌相關(guān)差異表達(dá)基因的基因本體論分析

表2 非小細(xì)胞肺癌相關(guān)差異表達(dá)基因的KEGG 通路分析

續(xù)表

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)和模塊選擇

利用MCODE 從DEGs的PPI 網(wǎng)絡(luò)中獲得了一個(gè)顯著的模塊，包含29 個(gè)上調(diào)基因和28 個(gè)下調(diào)基因，如圖2 和表3～6 所示。功能和KEGG 通路富集分析顯示在此模塊中的基因主要和細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、p53 信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、ECM-受體相互作用、PPAR 信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、趨化因子信號通路相關(guān)聯(lián)。

表3 模塊一細(xì)胞周期、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53 信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路

圖2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表4 模塊二ECM-受體相互作用、PPAR 信號通路、補(bǔ)充和凝固級聯(lián)通路

表5 模塊三趨化因子信號通路

表6 模塊四ECM-受體相互作用、PPAR 信號通路、補(bǔ)充和凝固級聯(lián)通路

2.4 差異miRNA-mRNA 對

從GSE63805 數(shù)據(jù)集中篩選出25 種不同表達(dá)miRNAs，和健康樣本相比較，在NSCLC 樣本中包含14 個(gè)上調(diào)和11 個(gè)下調(diào)miRNAs（對照）。如表7 所示，miR-9 是最明顯上調(diào)miRNA，而miR-451 是最明顯下調(diào)miRNA。基于miRanda、Pictar2 和Targetscan 數(shù)據(jù)庫，獲得miRNAs 預(yù)測靶標(biāo)。將靶標(biāo)與DEGs相對比，我們發(fā)現(xiàn)KIT、MME、S1PR1、LDLR、RECK 和ECT2。LDLR 是6 個(gè)miRNAs的潛在靶點(diǎn)，包括：miR-96、miR-31、miR-135b、miR-9、miR-429 和miR-130b。

表7 在非小細(xì)胞肺癌中差異表達(dá)的microRNAs

續(xù)表

3 討論

本研究共篩選出460 個(gè)DEGs，包括116 個(gè)上調(diào)基因和344 個(gè)下調(diào)基因，這些上調(diào)基因主要富集于細(xì)胞周期、P53 信號通路［6］和ECM-受體相互作用［7］中，并和癌癥關(guān)系密切，而下調(diào)基因主要富集于細(xì)胞黏附分子［8］、PPAR 信號通路［9］、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)［10］。在這些DEGs 中，57 個(gè)基因在PPI 網(wǎng)絡(luò)中有很高的度。功能和KEGG 通路富集分析揭示了基因在這個(gè)模塊中主要和細(xì)胞周期、p53 信號通路、ECM-受體相互作用、PPAR 信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)相聯(lián)系，并和癌癥關(guān)系密切。

細(xì)胞周期是一個(gè)緊密結(jié)合的過程，常在肺癌中異常表達(dá)。Li［11］證明了miR-146a-5p 能通過抑制CCND1 和CCND2的表達(dá)來抑制NSCLC 細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK1）mRNA的過表達(dá)在NSCLC-N6 細(xì)胞的增殖抑制中發(fā)揮重要作用［12］。GINS 復(fù)合體與細(xì)胞分裂周期（CDC）蛋白45 和微小染色體維持蛋白2-7 相關(guān)，形成CDC45-Mcm-GINS（CMG）復(fù)合體，這對DNA復(fù)制至關(guān)重要［13］。CDC20 是一個(gè)NSCLC 切除患者的陰性預(yù)后標(biāo)志，特別是那些組織學(xué)上有腺癌的患者［14］。有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)激酶BLUB1的突變導(dǎo)致紡錘體的顯性負(fù)性破壞，導(dǎo)致癌細(xì)胞染色體不穩(wěn)定［15］，Zhang 等［16］認(rèn)為，從NSCLC 到小細(xì)胞肺癌（SCLC）的惡性程度增加可能是由BUB1 升高引起的，而BUB1的升高很可能為其驅(qū)動因素。在肺腫瘤中，CHEK1的高表達(dá)和總生存率不佳相關(guān)［17］。在定量RT-PCR 篩選中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性淋巴結(jié)分層蛋白（SFN）的mRNA 表達(dá)有顯著性差異［18］。

包括細(xì)胞周期蛋白B1（CCNB1）在內(nèi)的亞網(wǎng)絡(luò)主要富集于p53 信號通路，這可能在胰腺導(dǎo)管腺癌中起重要作用［19］。利用下一代測序技術(shù)構(gòu)建并測序了cDNA 文庫，發(fā)現(xiàn)CDK1 富集于p53 信號通路［20］。芹菜素通過上調(diào)死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）的水平，以p53 依賴性的方式致敏NSCLC 細(xì)胞至TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21］。p53 可能在NSCLC的發(fā)生中起重要作用，因此可以考慮作為NSCLC的治療靶標(biāo)［22］。Akt 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Erk）的生存通路以及腫瘤抑制因子p53 是腫瘤細(xì)胞生長和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［23］。

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成絕大多數(shù)肺癌患者死亡的最主要原因。許多細(xì)胞外基質(zhì)ECM 相關(guān)分子被提出和癌癥細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)。自我更新通路，如ECM-受體相互作用通路與肺癌干細(xì)胞顯著相關(guān)［24］。NSCLC 腫瘤ECM 和健康組織的不同。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）通過CD36 受體信號通路誘導(dǎo)纖維狀I(lǐng) 型膠原沉積，并參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，有助于肝纖維化的病理生理過程［25］。Defilippis［26］報(bào)道CD36 是一種跨膜受體，協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)多種致瘤表型，包括脂肪細(xì)胞分化、血管形成、細(xì)胞-ECM 相互作用和免疫應(yīng)激，在多種無病基質(zhì)中被顯著抑制，并與高乳腺密度和腫瘤間質(zhì)相關(guān)。SPP1 是一種分泌型ECM 蛋白，與多種細(xì)胞表面整合素結(jié)合，刺激細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM 黏附和通訊［27］。Leung［28］證實(shí)了SPP1 在體外和體內(nèi)通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（HSC）活化和ECM 沉積，特別是通過調(diào)控纖維狀膠原-I的表達(dá)，是促纖維化形成的關(guān)鍵蛋白。雖然過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARg）的大量研究集中在PPARg 調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝的機(jī)制上，但最近的報(bào)道表明，PPARg 具有致瘤或抗腫瘤的作用［29］。Lin［30］的研究表明，TGFbeta 誘導(dǎo)的p（38）/β-catenin/PPARgamma 信號通路在促進(jìn)H460 細(xì)胞的EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。三苯氧胺可以降低CD36mRNA 表達(dá)、啟動子活性以及CD36 啟動子中PPARγ 反應(yīng)元件與PPARγ 蛋白的結(jié)合［31］。補(bǔ)體缺失是一種很有前途的腫瘤免疫治療模式，通過增強(qiáng)宿主對腫瘤的有效免疫反應(yīng)，減少腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)，從而抑制腫瘤生長，可作為聯(lián)合免疫治療的一個(gè)組成部分［32］。

miRNA 是一種小的非編碼RNA 分子，通過靶向3'UTR 來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而引起翻譯抑制或退化［33］。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs的失調(diào)是多種癌癥類型發(fā)病的原因，包括NSCLC［34-35］。在本研究中，我們確定了25 個(gè)DEMs，包括14 個(gè)上調(diào)和11 個(gè)下調(diào)的miRNAs 在NSCLC 中，其中，miR-9的上調(diào)最顯著，而miR-451的下調(diào)最顯著。之前也有報(bào)道類似的結(jié)果，miR-9 在NSCLC 組織中的表達(dá)水平顯著高于健康組織，并被確定為NSCLC的生物標(biāo)志物候選［36］。Tian［37］發(fā)現(xiàn)miR-451 增敏放射抗性的非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞通過增強(qiáng)細(xì)胞凋亡來上調(diào)對輻射的敏感性。Kanaoka［38］研究結(jié)果表明，血漿miR-451a 在NSCLC 復(fù)發(fā)患者中表達(dá)最高。miR-451a 與NSCLC 組織miR-451a 呈顯著正相關(guān)。miR-451a 外體與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯和分期密切相關(guān)。miR-451a 表達(dá)水平低于NSCLC 患者總生存期縮短也有相關(guān)性。

總之，本研究目的是通過全面的生物信息學(xué)分析來確定DEGs，以發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)記物和預(yù)測疾病的進(jìn)展。本研究共篩選出460 個(gè)DEG 和25 個(gè)DEM，其中CCNB1、CDK1、CDC45、CCNB2、BUB1、CD36 和miR-9、miR-451 等多個(gè)miRNA 可能是與NSCLC 關(guān)系密切的關(guān)鍵基因。研究結(jié)果表明，數(shù)據(jù)挖掘和集成是預(yù)測NSCLC 發(fā)生、發(fā)展的有用工具，有助于進(jìn)一步了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。為了將這些基因表達(dá)譜應(yīng)用于臨床實(shí)踐，有必要提高獨(dú)立數(shù)據(jù)集分析模型的可靠性和可重復(fù)性。本研究為NSCLC的診斷和治療提供了新的思路。