一株Ⅱ型草魚呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的分離鑒定及全基因組序列分析

曾偉偉，董寒旭，楊 映，陳言峰，于 輝，李 華

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225；2.廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528225；3.廣東普通高校動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528225）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國(guó)最重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚，其產(chǎn)量約占全國(guó)淡水魚生產(chǎn)總量的20%［1］，除西藏、青海零星養(yǎng)殖外，在我國(guó)各地均有一定規(guī)模養(yǎng)殖。然而，由草魚呼腸孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）引起的草魚出血病嚴(yán)重地阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［2］。GCRV 隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科一新成員，是中國(guó)大陸分離的第1 株魚類病毒。該病毒主要引起中國(guó)淡水養(yǎng)殖主要品種草魚在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率可高達(dá)60%以上。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅漁業(yè)生產(chǎn)［3］。草魚呼腸孤病毒是正二十面體粒子，呈5∶3∶2 對(duì)稱球形顆粒，直徑為65～72 nm，無(wú)囊膜，具有雙層衣殼，GCRV 基因組由11 條分節(jié)段的雙鏈RNA（ds RNA）組成，RNA的3'端不含poly（A），3'和5'末端各含有5～7 個(gè)堿基（bp）的保守序列。目前已經(jīng)報(bào)道GCRV 有40 多個(gè)分離株，包 括GCRV、854、861、873、875、876、9014、991、V、H-962、ZV-8802、854、HZ08、JX09-01、JX09-02、GD108、104、106、109、GZ1208 等，初步研究表明，不同分離株在致細(xì)胞病變、毒力、基因組電泳帶型、基因組序列和特征等各方面有較大差異［1，4-9］。GCRV 感染細(xì)胞，有的毒株可感染單層培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），而有的毒株不產(chǎn)生CPE，但能在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制。GCRV 感染細(xì)胞的能力與其感染魚體的毒力并不都是一致的，有的毒株（如GCRV873、JX0901、GZ1208）對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染力較強(qiáng)，但是對(duì)魚體的毒力卻較弱，有的毒株恰恰相反（如GCRV861、GD108、V 和9014 株）。由于呼腸孤病毒含分段dsRNA 基因組且其3'端不含poly（A）尾的特性，使得其基因組測(cè)定有一定的難度。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用單引物擴(kuò)增技術(shù)，越來(lái)越多的水生呼腸孤病毒完成了全基因組序列測(cè)定。目前GenBank 中可查詢到已完成全基因組序列的草魚呼腸孤病毒有10 多株，分別是873 株、HZ08株、GD108 株、104 株、HeNan988 株、918 株、106 株、HuNan794 株、109 株、GZ1208 株等［4-7，10］。GCRV 基因組序列的測(cè)定和分析比較，為不同GCRV 分離株的分類進(jìn)化提供了重要的依據(jù)。

2020 年8 月份，廣東佛山某養(yǎng)殖場(chǎng)草魚爆發(fā)出血性疾病，并持續(xù)死亡，每天死亡草魚幾十尾到上千尾不等，患病草魚的主要臨床癥狀為體側(cè)肌肉、鰭基部、口腔、鰓蓋、眼眶明顯充血，剝開皮膚，肌肉呈點(diǎn)狀充血，剖檢可見(jiàn)腸道有不同程度的充血發(fā)紅，其他臟器未見(jiàn)明顯的癥狀。采集具有典型出血病癥狀的病樣，進(jìn)行病毒分離、回歸感染試驗(yàn)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)鑒定以及全基因組序列分析，表明該分離株為一株II 型GCRV 強(qiáng)毒株，為揭示GCRV的流行態(tài)勢(shì)變化和進(jìn)一步防控GCRV 提供重要數(shù)據(jù)，為豐富該病的病原庫(kù)及進(jìn)行各地分離株比較分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

M199 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶為Gibco 公司產(chǎn)品；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker 購(gòu)自天根生物有限公司；Trizol Reagent 購(gòu)于Invitrogen 公司；DNA 酶（RNAase free）、RNA 酶、綠豆核酸酶（MB）及其反應(yīng)緩沖液，購(gòu)自NEB 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于寶生物（Takara）公司；T4 RNA ligase 購(gòu)自Promega 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 抗體、細(xì)胞及毒株

抗II 型GCRV VP5 蛋白的多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存［11］，草魚腎細(xì)胞（CIK）系由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，用于病毒的分離和增殖；GCRV 873 株病毒由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所惠贈(zèng)，GCRV 104株病毒由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究員長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)。

1.3 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用草魚購(gòu)自廣州景洋漁業(yè)有限公司，平均體長(zhǎng)為12.0 ± 0.5 cm，體重為25.0 ± 0.5 g，在進(jìn)行感染試驗(yàn)前全部試驗(yàn)魚都在實(shí)驗(yàn)室魚缸中暫養(yǎng)2 周，同時(shí)經(jīng)三重PCR 檢測(cè)為GCRV 陰性。

1.4 樣品的采集及處理

病料組織取自廣東佛山地區(qū)一草魚養(yǎng)殖場(chǎng)的患病草魚，采取發(fā)病魚的肝、腎、脾和腸道，用50%甘油磷酸緩沖液保存，置于低溫環(huán)境中帶回實(shí)驗(yàn)室。用PBS（pH7.2）將保存于50%甘油磷酸緩沖液中的組織漂洗3 次，稱取重量，將組織剪成小塊，用組織勻漿器磨碎，用M199 培養(yǎng)基制成1∶10的組織勻漿液,反復(fù)凍融3 次后，依次經(jīng)3 000 rpm/min、6 000 rpm/min 和10 000 rpm/min，每次離心10 min，去沉淀，上清液經(jīng)濾膜孔徑為0.22 μm的微孔濾器過(guò)濾除菌，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的分離與傳代

將上述處理好的組織懸液經(jīng)三重RT-PCR 方法［12］檢測(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性樣品的上清液接種于長(zhǎng)成致密單層CIK 細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，28 ℃孵育1 h，之后加入含5 μg/mL 胎牛血清的M199 維持培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)。病毒傳代時(shí)，將病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2 次，再按上述接種方法做傳代培養(yǎng)。

1.6 超薄切片電鏡觀察

收集盲傳至第2 代病毒感染5 d 后的細(xì)胞，用戌二醛和四氧化鋨雙固定，梯度乙醇中脫水，苯二甲酸二丙烯酯包埋，制備超薄切片，在JEM-100CX II 透射電鏡下觀察和拍片。

1.7 PCR 鑒定

取CIK 細(xì)胞培養(yǎng)的第1、3、6 和10 代病毒原液及未感染病毒的CIK 細(xì)胞液各200 μl，于4 ℃3 000 g 離心10 min,收集上清液。按照Trizol Reagent 說(shuō)明書的步驟進(jìn)行病毒感染細(xì)胞總RNA的提取，然后按照TaKaRa AMV 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行三重PCR檢測(cè)［12］，PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

1.8 間接免疫熒光鑒定

間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，按照前面介紹的方法準(zhǔn)備細(xì)胞和接種病毒，待接種病毒5 d 后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（pH7.4）潤(rùn)洗2 次，5 min/次；然后用預(yù)冷的甲醇2 mL/孔，-20 ℃固定30 min，棄去甲醇固定液，室溫放置10 min，PBS 洗3 次，5 min/次；加入1% Triton X-100（用pH7.4的PBS 稀釋）200 μL/孔，室溫透化處理30 min，PBS 洗3 次，5 min/次；加入3% 牛血清白蛋白200 μL/孔，室溫封閉30 min，吸出牛血清白蛋白，加入含1% 牛血清白蛋白PBS 按1∶500 稀釋的VP4 單克隆抗體200 μL/孔，室溫作用60 min，PBS 洗3 次，5 min/次；加入用PBS 1∶2 000 稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光抗體，200 μL/孔，室溫作用60 min，PBS 洗3 次，5 min/次；同時(shí)設(shè)立感染873 和104 株的對(duì)照和未接種病毒的陰性對(duì)照。將最后洗滌好的細(xì)胞培養(yǎng)板置倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照并記錄。

1.9 回歸感染試驗(yàn)

將制備好的組織勻漿懸液和CIK 細(xì)胞病毒液過(guò)濾除菌處理后稀釋至病毒滴度TCID50為10-3/0.1 ml，然后注射當(dāng)年10～15 cm 大小的草魚，同時(shí)設(shè)注射無(wú)菌PBS的陰性對(duì)照組，每尾草魚腹腔注射0.2 ml，每組試驗(yàn)魚均為20 尾。試驗(yàn)期間水溫控制在28 ℃左右，每天觀察各組試驗(yàn)魚的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)3 w。同時(shí)在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)攻毒后死亡或?yàn)l臨死亡的魚以及攻毒2 w 后未死亡或者發(fā)病的魚分別采用三重RT-PCR 進(jìn)行GCRV 病毒檢測(cè)。

1.10 全基因組序列測(cè)定及分析

采用TRIzol 試劑盒從感染細(xì)胞的病毒中提取病毒RNA，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。病毒cDNA的合成、克隆和測(cè)序參照單引物擴(kuò)增技術(shù)［5，10］和5' RACE 方法進(jìn)行［13］。病毒基因組序列采用DNASTAR 7.0 軟件包進(jìn)行分析，其他用于比對(duì)分析的GCRV 基因組序列收集自NCBI 中的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)。然后采用Clustal X 2.1 進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA v7.0.28 軟件通過(guò)臨位相連法（Neighbor-Joining，N-J）用RdRp 蛋白的氨基酸序列繪制GCRV 各分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 計(jì)算重復(fù)1 000 次。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng)

病料接種CIK 細(xì)胞后，連續(xù)觀察7 d，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，盲傳至第10 代，連續(xù)觀察仍未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。取第1、3、6 和10 代病毒原液進(jìn)行三重RT-PCR 檢測(cè)，均能擴(kuò)增出特異性目的條帶，大小為200 bp 左右，PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序表明與GCRV-HZ08、GD108、106、109 等草魚呼腸孤病毒分離株的同源性較高，而未感染病毒的CIK 細(xì)胞未能擴(kuò)增出目的條帶，如圖1 所示，其中1～4 分別為分離病毒盲傳第1、3、6 和10 代病毒原液，NC 為未感染病毒的CIK 陰性對(duì)照，M 為DNA 分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 病毒分離的PCR 鑒定結(jié)果

2.2 電鏡觀察鑒定結(jié)果

新分離株GD20-08 株感染CIK 細(xì)胞超薄切片在電鏡下觀察：透射電鏡下CIK 細(xì)胞胞漿中有大量病毒粒子呈散在分布，直徑大約為70 nm，平面圖像呈六邊形或近圓形，無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)，中央有一電子密度致密區(qū)域，而未感染病毒液的對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有觀察到病毒粒子，如圖2 所示，其中GD20-08 為感染新分離株的CIK 細(xì)胞，CIK-NC 為沒(méi)有感染病毒的對(duì)照細(xì)胞。

圖2 病毒分離的電鏡鑒定結(jié)果

2.3 間接免疫熒光鑒定結(jié)果

間接免疫熒光反應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下觀察，特異性的熒光細(xì)胞呈黃綠色，胞漿中黃綠色顆?；蛄涟邽椴蒴~呼腸孤病毒存在的陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果表明接種新分離株的CIK 細(xì)胞反應(yīng)呈陽(yáng)性，而接種873（I 型GCRV）和104（III 型GCRV）以及CIK 細(xì)胞對(duì)照無(wú)反應(yīng)，如圖3 所示，其中GD20-08、873 和104 分別為相應(yīng)分離株病毒感染的細(xì)胞，NC 為沒(méi)有感染病毒的對(duì)照細(xì)胞，表明該分離株為II 型GCRV，并命名為GD20-08 株。

圖3 病毒分離的間接免疫熒光

2.4 回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

在注射后的第5 d，攻毒組草魚開始出現(xiàn)游動(dòng)失常、厭食、反應(yīng)遲鈍的癥狀，繼而，病魚體色變黑，身體失去平衡，出現(xiàn)這種癥狀的病魚，在一天內(nèi)即死亡。死亡的草魚除體色發(fā)黑外，多數(shù)發(fā)病魚可見(jiàn)體表有不同程度的出血點(diǎn)，如眼眶、鰓蓋周圍、下顎、尾鰭等部位，也有發(fā)病魚有腸炎癥狀，如圖4 所示。

圖4 病毒分離的回歸感染草魚結(jié)果

攻毒14 d 后草魚死亡率達(dá)96.7%（29/30），而沒(méi)有感染病毒的對(duì)照組草魚沒(méi)有明顯的臨床癥狀，也無(wú)一例死亡。取發(fā)病死亡的魚內(nèi)臟組織進(jìn)行三重RT-PCR 檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出一段200 bp 大小的條帶，說(shuō)明病毒可以在草魚體內(nèi)增殖。制備發(fā)病死魚的組織液再次感染CIK 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離后，三重RTPCR 檢測(cè)均為陽(yáng)性。

2.5 基因組序列分析

GCRV GD20-08 株基因組全長(zhǎng)為24.703 Kb，S1 至S11 基因組大小為3 928 bp 至10 24 bp，在Genbank 中的登錄號(hào)分別KU254567～ KU254576，除S4 節(jié)段的為5'GUAUUUU…UUCAUC 3'，其他各節(jié)段擁有共同的末端保守序列5'GUAAUUU…UUCAUC 3'，這一點(diǎn)與106 株的完全一致，而與HZ08、GD108和109 株都有微小的差異。另外，鄰近末端保守序列，各個(gè)基因節(jié)段又擁有節(jié)段特異的倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列與呼腸孤病毒科病毒毒株的基本特征一致，在病毒對(duì)其基因組進(jìn)行篩選以及裝配過(guò)程中可能起到重要作用。GD20-08 株基因組各節(jié)段只有惟一的一個(gè)ORF，預(yù)測(cè)只編碼惟一蛋白。S1 基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為1 296 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP1），分子量為143.8 KDa。推測(cè)S1 基因編碼蛋白均具有鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶的功能，參與mRNA的加帽；S2 基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為1 273 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP2），分子量分別為142.6 KDa，S2 基因編碼的VP2 結(jié)構(gòu)蛋白，為病毒的RNA 依賴性RNA 聚合酶（RdRp）；S3 基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為1 232 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP3），分子量分別為135.7 KDa，S3 基因編碼的VP3 為病毒的核心蛋白，與MRV的λ1 和ARV的λA 蛋白有較近的親緣關(guān)系，可能具有NTPase的功能，在病毒基因組轉(zhuǎn)錄的時(shí)候起到解旋酶的功能；S4 基因分別編碼一個(gè)長(zhǎng)度為716 氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1），分子量為79.1 KDa。NS1 與MRV 和ARV的μN(yùn)S 蛋白有很近的親緣關(guān)系，可能與病毒的包涵體形成及細(xì)胞骨架有關(guān)聯(lián)；S5基因分別編碼一個(gè)長(zhǎng)度為726 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP5），分子量為80.7 KDa，VP5 與MRV的2 和ARV的A 蛋白有很近的親緣關(guān)系，推測(cè)可能是病毒內(nèi)衣殼的構(gòu)件，具有NTPase 功能，是一個(gè)RNA 結(jié)合蛋白，還能結(jié)合微管，決定毒株的表型，輔助RdRp 發(fā)揮作用；S6 基因分別編碼一個(gè)長(zhǎng)度為650 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP，4），分子量為68.3 KDa。分析預(yù)測(cè)表明S6的編碼蛋白VP4 與MRV的1 和ARV的B 蛋白有很近的親緣關(guān)系，VP4 蛋白是病毒的主要的外衣殼蛋白，大約占病毒蛋白總重量的一半，在病毒的細(xì)胞侵入和組裝方面有重要作用；S7 基因均編碼一個(gè)長(zhǎng)度為512 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白（VP6），分子量為56 KDa，VP6 可能為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白；S8 能夠編碼一個(gè)長(zhǎng)達(dá)361 個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，分子量為41.20 KDa，其功能未知；S9 基因均編碼一個(gè)長(zhǎng)度為418 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白VP7，分子量分別為47.9 KDa，VP7 蛋白與MRV的2 和ARV的A 蛋白有很近的親緣關(guān)系；S10 基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為345 氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量分別為38.4 KDa，分析表明S10的編碼蛋白與MRV 和ARV的NS 蛋白具有很近的親緣關(guān)系；S11 基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為309 氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為35.4 KDa，如表1 所示。

表1 GD20-08 株草魚呼腸孤病毒病毒基因組各節(jié)段特點(diǎn)

GD20-08 分離株與其他GCRV 分離株的核苷酸和氨基酸序列同源性比較分析表明，該分離株與HZ08、GD108 等Ⅱ型毒株同源性較高，核苷酸序列的同源性從95.8%至99.2%不等，氨基酸序列的同源性從94.3%至100%不等，其中氨基酸序列同源性最低的為S7 基因編碼的VP56 蛋白，為94.3%至98.4%，最高的為S10 基因編碼蛋白，為99.4%至100%，如表2 所示。而GD20-08 株各節(jié)段基因編碼的蛋白氨基酸序列的同源性與美國(guó)草魚呼腸孤病毒（AGCRV），GCRV 873（Ⅰ型），HGDRV（Ⅲ型）的同源性則比較低，從16.1%至46.7%不等，大節(jié)段基因核苷酸序列及編碼的蛋白氨基酸序列其同源性比小節(jié)段的更高，其中S2 節(jié)段編碼的RNA 依賴的RNA 聚合酶VP2 蛋白最為保守，同源性均在45%以上，小節(jié)段基因編碼的蛋白，比如VP56，VP41，NS38，VP46的同源性只在20%左右甚至更低，如表2 所示。

表2 GD20-08 與其他分離株各節(jié)段核苷酸和編碼的氨基酸序列相似性比較

2.6 遺傳進(jìn)化分析

RdRps 被認(rèn)為是呼腸孤病毒作為保守的蛋白，根據(jù)水生呼腸孤病毒RdRp 蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明，所有的草魚呼腸孤病毒分離株聚為3 大類，GD20-08 和GCRV-HZ08、GCRVGD108、Huan1307、GCRV106 及109的親緣關(guān)系較近，與他們共同構(gòu)成一個(gè)主干支，即為前面研究報(bào)道的基因Ⅱ型，GCRV 873 和GZ1208 等聚為另外一類，為前面研究報(bào)道的基因Ⅰ型，GCRV 104 則單獨(dú)聚為一類，為基因型Ⅲ型。通過(guò)RdRps 蛋白分子進(jìn)化分析，可將草魚源呼腸孤病毒劃分為3 個(gè)不同的進(jìn)化群，如圖5 所示。

圖5 基于GCRV 各分離株VP2（RdRps）蛋白序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

近年來(lái)，隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，草魚的產(chǎn)量每年都呈上升趨勢(shì)，但草魚呼腸孤病毒引起的草魚出血病問(wèn)題并未得到有效緩解，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年由于草魚出血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失至少達(dá)10 億［3，14-15］，嚴(yán)重影響了廣大草魚養(yǎng)殖者的積極性和我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)于該疫病的研究意義也顯得越來(lái)越重要。由于GCRV 各毒株間基因組存在較大的差異，因此，進(jìn)行草魚呼腸孤病毒野毒株的分離、鑒定及全基因組序列特征的分析，是明確GCRV 不同分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系及開發(fā)草魚出血病防控技術(shù)的關(guān)鍵。

通過(guò)對(duì)廣東佛山采集到的病料進(jìn)行病毒分離測(cè)序鑒定，結(jié)果表明，新分離株GCRV GD20-08 與GCRV-HZ08、GD108 等Ⅱ型GCRV 分離株的同源性較高。隨后，通過(guò)電鏡觀察和間接免疫熒光鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證從患病草魚體內(nèi)分離到了一株新的草魚呼腸孤病毒，該分離株在電鏡下觀察到的細(xì)胞內(nèi)排布特點(diǎn)與Ⅱ型GCRV 相似，而與873 相差較大。用抗Ⅱ型GCRV 分離株的抗體進(jìn)行間接免疫熒光鑒定表明，該抗體可以很好地識(shí)別GD20-08 分離株，而不能識(shí)別873 以及104 株，說(shuō)明GD20-08 有較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)，而與873 及104 株的免疫交叉反應(yīng)較弱或者沒(méi)有交叉反應(yīng)，該結(jié)果和Wang 等［16］的研究結(jié)果一致。回歸感染結(jié)果表明新分離株GD20-08 對(duì)草魚的致死率達(dá)到96.7%，為一株超強(qiáng)毒株，可以作為感染模型建立、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)等研究中的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株。因此，GD20-08的分離鑒定，對(duì)于GCRV的病原學(xué)研究以及防控技術(shù)和防控產(chǎn)品的開發(fā)均具有重要的意義。

利用單引物擴(kuò)增技術(shù)，獲得了GD20-08 分離株11 個(gè)節(jié)段的全基因組序列，通過(guò)將GD20-08 和其他GCRV 分離株的基因組序列比對(duì)分析表明，GD20-08 與HZ08，GD108 等Ⅱ型GCRV 各節(jié)段核苷酸序列的同源性在95.8%至99.2%之間，氨基酸序列的同源性在94.3%至100%之間，與873、GZ1208 等Ⅰ型GCRV 及104 各節(jié)段核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別在28.6%至52%之間和16.1%至46.7%之間。有趣的是，被認(rèn)為最保守的RdRp 蛋白在GCRV Ⅱ型中并非最為保守，而是S10 節(jié)段編碼蛋白，同源性在99.4%至100%之間。而變異較大是S7 和S8 節(jié)段基因，同源性多數(shù)均在94%至98%之間。此外，通過(guò)對(duì)GD20-08 與HZ08、GD108 等Ⅱ型病毒各節(jié)段基因核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，很多節(jié)段的核苷酸序列同源性相對(duì)較低，但是氨基酸序列的同源性則非常高，比如S2節(jié)段Huan1307 與AH528的核苷酸序列同源性為97.9%，氨基酸序列同源性則高達(dá)99.5%，S4 節(jié)段與109的核苷酸序列同源性為98.6%，氨基酸序列同源性則為99.9%；S10 節(jié)段與HZ08、GD108、AH528的核苷酸序列同源性分別為98.9%、98.9%和98.8%，而氨基酸序列同源性均為100%。這種現(xiàn)象在其他GCRV 分離株之間也存在，說(shuō)明GCRV的多數(shù)變異均為無(wú)意變異。

總之，本研究從具有典型出血癥狀的草魚體內(nèi)分離到一株Ⅱ型GCRV 新分離株GD20-08，為一株毒力超強(qiáng)毒株。同時(shí)完成了GD20-08 全基因組序列測(cè)定，通過(guò)比較各節(jié)段基因和蛋白序列及基因組特征，表明新分離株GD20-08 與GCRV-HZ08、GCRV-GD108 等草魚呼腸孤病毒較為相近，而與GCRV-873、GCRV-104、AGCRV 等病毒相差甚遠(yuǎn)，基于RdRp 蛋白的遺傳進(jìn)化分析也表明GD20-08 與GCRVHZ08、GCRV-GD108 等草魚呼腸孤病毒親緣關(guān)系較近，并且GCRV 總體上分為三個(gè)基因型，與前人研究的結(jié)果一致［5-7，10，17］。本研究結(jié)果為草魚呼腸孤病毒的基因變異和遺傳進(jìn)化分析提供了重要的基因材料和理論基礎(chǔ)。