比格犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)研究*

劉清平 黃永平 陳 蕓 萬(wàn) 娟 田 松 賀爭(zhēng)鳴 胡曼麗 丁 一 白 蘭 張 鑫

(1.贛南創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；贛南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000)(2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)(3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)(4.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)(5.中國(guó)食品藥品檢定研究所，北京 100050)(6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)業(yè)態(tài)的改變，我國(guó)養(yǎng)寵理念在過(guò)去十余年發(fā)生明顯改變，寵物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧胰?、伴侶的角色。目前全國(guó)寵物數(shù)量超過(guò)1億只，其中有約50%的寵物正承受著關(guān)節(jié)疾病的困擾[1]。以寵物犬為例，先天關(guān)節(jié)發(fā)育不良和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多見(jiàn)于幼犬，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎常見(jiàn)于成年犬，犬關(guān)節(jié)炎則多發(fā)于老年犬[2]。寵物關(guān)節(jié)保健至關(guān)重要，及早對(duì)寵物進(jìn)行關(guān)節(jié)養(yǎng)護(hù)能有效減輕寵物不同時(shí)期關(guān)節(jié)損傷和疼痛。犬關(guān)節(jié)炎臨床治療主要采取抗炎和鎮(zhèn)痛措施，而批準(zhǔn)上市的寵物專(zhuān)用抗炎鎮(zhèn)痛藥稀少，常用藥物美洛昔康在有效治療犬關(guān)節(jié)炎的同時(shí)卻引起胃腸道不良反應(yīng)，不適合作為長(zhǎng)期養(yǎng)護(hù)關(guān)節(jié)的策略。此外，由于缺乏對(duì)寵物關(guān)節(jié)疾病機(jī)制的深入研究和理解，目前市面上關(guān)于寵物的關(guān)節(jié)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，大多只停留在補(bǔ)鈣或單種成分補(bǔ)充的初級(jí)階段，導(dǎo)致眾多寵物的關(guān)節(jié)問(wèn)題無(wú)法有效解決。因此，充分認(rèn)識(shí)犬關(guān)節(jié)發(fā)育的代謝特征，有針對(duì)性地補(bǔ)充不同時(shí)期關(guān)節(jié)所需營(yíng)養(yǎng)，才能有效地保證寵物關(guān)節(jié)和骨骼的健康。

代謝組學(xué)關(guān)注內(nèi)源性代謝物(相對(duì)分子質(zhì)量小于1 500)在生命體系受外界刺激(如疾病侵襲、藥物干預(yù)、環(huán)境變化等)、病理生理變化以及本身基因突變所產(chǎn)生的應(yīng)答變化規(guī)律[3-4]。目前廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥靶篩選、個(gè)性化藥物治療、作用機(jī)制研究和基因功能闡明，為疾病過(guò)程認(rèn)識(shí)和藥物理論體系的研究提供了整體的思路和系統(tǒng)的方法[4-5]。非靶向代謝組學(xué)使用高分辨質(zhì)譜儀，對(duì)樣本中的代謝物進(jìn)行無(wú)偏向、大規(guī)模、系統(tǒng)性檢測(cè)，最大程度反映生物體內(nèi)代謝水平擾動(dòng)情況[6]。液相色譜法與質(zhì)譜法(LC-MS)相結(jié)合，在分析復(fù)雜生物流體(如關(guān)節(jié)腔滑液)方面顯示出巨大優(yōu)勢(shì)[7]。

本研究使用超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-Q-TOF MS)進(jìn)行犬關(guān)節(jié)腔滑液代謝組學(xué)檢測(cè)和分析，選取幼年和成年比格犬的關(guān)節(jié)滑液，研究這兩個(gè)年齡段的關(guān)節(jié)腔滑液的代謝特征，尋找其在犬不同年齡段的代謝差異，從而發(fā)現(xiàn)比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育與關(guān)節(jié)滑液代謝成分變化的關(guān)系。本研究基于LC-MS的代謝組學(xué)譜作為量化關(guān)節(jié)腔滑液內(nèi)代謝物的工具，發(fā)現(xiàn)犬在不同發(fā)育階段的關(guān)節(jié)代謝標(biāo)志物，用于探索犬關(guān)節(jié)發(fā)育的特征和關(guān)節(jié)養(yǎng)護(hù)的策略研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選取體格正常的18只幼年(<12個(gè)月；雌、雄各9只)比格犬和16只成年(≥12個(gè)月且≤65個(gè)月；雌、雄各8只)比格犬，在受控的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境【12 h∶12 h晝夜間斷照明，溫度(23.5±1)℃，相對(duì)濕度(60±10)%】中適應(yīng)性飼養(yǎng)。犬基礎(chǔ)飼料購(gòu)買(mǎi)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行基礎(chǔ)體檢，評(píng)估比格犬骨關(guān)節(jié)和生理健康水平。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查，倫理審批號(hào)：2021334，符合美國(guó)國(guó)家科學(xué)院和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。

1.2 設(shè)備及試劑

AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)、Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)、低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5430R)、色譜柱(Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column)、DigiEye 380 DR X線(xiàn)攝影裝置(深圳邁瑞)、乙腈(Merck,1499230-935)、乙酸銨(Sigma,70221)、甲醇(Fisher, A456-4)、氨水(Fisher, A470-500)、硫酸阿托品(吉林華牧)、舒泰50(法國(guó)維克)。

1.3 血常規(guī)分析

動(dòng)物完成基礎(chǔ)體檢后，將采血針插入頭遠(yuǎn)端靜脈采集少量靜脈血。將全血標(biāo)本送往惠康動(dòng)物檢測(cè)(武漢)有限公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)血液檢查。

1.4 骨關(guān)節(jié)X線(xiàn)分析

為防止實(shí)驗(yàn)犬麻醉后食道中食靡和水反流導(dǎo)致窒息死亡，X線(xiàn)檢查前對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行常規(guī)禁食禁水(禁食12 h，禁水4 h)。麻醉采用0.04 mg/kg皮下注射硫酸阿托品，15 min后按5 mg/kg靜脈推注舒泰50，待實(shí)驗(yàn)犬意識(shí)消失，全身肌肉松弛后拍攝X線(xiàn)片。將犬置于診斷床上“仰臥保定”，進(jìn)行腹背位拍片，X線(xiàn)片暗盒放在兩髖關(guān)節(jié)與診斷床之間，薦椎與腰椎緊貼暗盒的中心線(xiàn)。一助手握住犬的兩前腳向前拉使兩個(gè)腕關(guān)節(jié)與診斷床的中心線(xiàn)成等距離平行，另一助手緊握兩個(gè)膝關(guān)節(jié)向后拉使兩股骨與診斷床的中心線(xiàn)或等距離平行。根據(jù)犬體型選擇投照條件，本實(shí)驗(yàn)中投照條件為70 kV，2.5 mAs，F(xiàn)FD=56 cm。

1.5 關(guān)節(jié)滑液采集

使用1 mL注射器從比格犬左后肢膝關(guān)節(jié)抽取關(guān)節(jié)滑液樣本0.1 mL，避免血液及毛發(fā)等污染。將關(guān)節(jié)滑液收集到EP管中，通過(guò)在室溫環(huán)境下4 000 r/min離心20 min，從滑液中除去細(xì)胞，然后在液氮中快速冷凍至少15 min，并在-80 ℃下儲(chǔ)存。

1.6 非靶向代謝組學(xué)

在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍關(guān)節(jié)滑液樣品，將100 μL樣品與400 μL預(yù)冷的甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1, v/v)渦旋混勻，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，然后離心20 min(12 000 r/min，4 ℃)，取上清真空干燥。將干燥的樣品重新溶解在100 μL乙腈水溶液(1∶1，v/v)中并渦旋混合，然后離心15 min(12 000 r/min，4℃)，收集上清液送往上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析。

關(guān)節(jié)滑液樣品的代謝物在Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱進(jìn)行分離。柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相組成A含有25 mmol乙酸銨和25 mmol氨水，流動(dòng)相組成B含乙腈。根據(jù)以下梯度程序?qū)崿F(xiàn)色譜分離：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，65% B；7～8 min，40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，95% B；和 9.1～12 min，95% B。整個(gè)過(guò)程中將樣品置于4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中。以隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣品分析，并在隊(duì)列中插入質(zhì)控樣品以監(jiān)測(cè)和評(píng)估系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

樣品經(jīng)色譜分離后，用Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用電噴霧電離(離子源溫度：600 ℃)進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測(cè)(離子噴霧電壓：±5 500 V，正負(fù)兩種模式)。MS-only 采集模式的m/z范圍設(shè)置為60至1 000 u，其掃描累積時(shí)間為0.20 s/譜。自動(dòng)MS/MS采集模式下的m/z范圍設(shè)置為25至1 000 u，累積時(shí)間為0.05 s/譜。離子掃描采用數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集，選擇峰強(qiáng)度值篩選模式。去簇電位為±60 V(正負(fù)兩種模式)，碰撞能量為(35±15)eV。動(dòng)態(tài)排除4 u以?xún)?nèi)的同位素離子，每次掃描采集10個(gè)碎片圖譜。

將Wiff格式的原始數(shù)據(jù)通過(guò)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成mzXML文件，然后導(dǎo)入XCMS軟件獲取可用數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正、提取峰面積。對(duì)XCMS提取得到的數(shù)據(jù)首先進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 多元數(shù)據(jù)分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化(Normalization)、立方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(Cube root transformation)、Pareto標(biāo)尺化(Scaling)等處理，以減少變量方差異性，增加數(shù)據(jù)間的可比性。使用ropls R包、構(gòu)建有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型，鑒別模型中對(duì)于區(qū)分各組間代謝譜差異貢獻(xiàn)較大的代謝物。并計(jì)算了OPLS-DA模型中投影的變量重要性(VIP)。每個(gè)變量的VIP值表示特定代謝物對(duì)分類(lèi)的貢獻(xiàn)。采用VIP值>1和相應(yīng)的P值<0.05篩選變化顯著的代謝物。

1.8 差異代謝物分析

使用HMDB 5.0版(https://hmdb.ca/)對(duì)所得代謝物進(jìn)行校對(duì)，以確定它們的來(lái)源是內(nèi)源性還是外源性。然后，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋代謝產(chǎn)物。在KEGG通路富集分析中，評(píng)估屬于某個(gè)通路的代謝物出現(xiàn)的頻率是否比隨機(jī)預(yù)期的更頻繁，以確定受到顯著影響的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)通路。使用z score方法通過(guò)公式y(tǒng) =(真實(shí)值-所有樣品的平均值)/所有樣品的方差來(lái)歸一化各種代謝物的水平。采用差異豐度(Differential abundance, DA)評(píng)分來(lái)捕捉途徑中所有代謝物的總體趨勢(shì)。在本研究中應(yīng)用 Benjamini-Hochberg 校正的 Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算某個(gè)途徑中所有代謝物的差異豐度得分。代謝物豐度的增加/減少定義為陽(yáng)性/陰性DA評(píng)分。具體來(lái)說(shuō)，得分為1表示該途徑中所有代謝物的豐度增加，而DA得分為-1表示所有代謝物的豐度降低。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖

實(shí)驗(yàn)選取體格正常的比格犬，首先對(duì)其左后肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行X線(xiàn)影像檢查，然后從左后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)抽取關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本100 μL，進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)。分析比格犬關(guān)節(jié)滑液的整體代謝圖譜，雌、雄性比格犬各自在幼年與成年時(shí)期的代謝差異，以及雌性與雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中關(guān)節(jié)滑液的代謝異同(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

2.2 比格犬血常規(guī)和膝關(guān)節(jié)X線(xiàn)影像分析

表1血常規(guī)分析顯示，幼年犬血液中大部分免疫相關(guān)細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的含量正常，白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞含量略超出臨床參考值范圍，說(shuō)明部分幼年犬存在感染和輕度炎癥，可能是由于幼年犬免疫力較低所致。圖2犬X線(xiàn)影像顯示，幼年犬和成年犬的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)均屬正常，無(wú)顯著性膝關(guān)節(jié)病變，包括關(guān)節(jié)骨對(duì)位不良、韌帶損傷、骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、腫瘤等，可排除關(guān)節(jié)病變導(dǎo)致的關(guān)節(jié)滑液代謝異常。

圖2 比格犬左后肢膝關(guān)節(jié)X線(xiàn)影像分析

表1 比格犬血常規(guī)指標(biāo)及參考范圍

2.3 比格犬關(guān)節(jié)滑液的整體代謝圖譜

采集上述健康比格犬關(guān)節(jié)滑液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)，利用差異代謝物精確m/z值在HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、LIPID MAPS(http：//www.Lipidmaps.Org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合差異代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息(加合離子、準(zhǔn)確質(zhì)荷比、保留時(shí)間、MSE二級(jí)信息)，尋找信息匹配的可能代謝物。本項(xiàng)目最終共鑒定出1 604種代謝物，其中正離子模式鑒定出1 055種代謝物，負(fù)離子模式鑒定出549種代謝物。圖3A所示為幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬顯著性差異代謝物的層次聚類(lèi)熱圖，圖中每行代表一個(gè)差異代謝物(即縱向?yàn)轱@著性差異表達(dá)的代謝物)，每列代表一組樣品(即橫向?yàn)闃悠沸畔?，黃色代表顯著性上調(diào)，藍(lán)色代表顯著性下調(diào)，顏色深淺表示上、下調(diào)的程度。

根據(jù)化學(xué)分類(lèi)歸屬信息，將本項(xiàng)目鑒定到的所有代謝物(合并正、負(fù)離子鑒定到的代謝物)分為8類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各類(lèi)代謝物數(shù)量及所占比例如圖3B，C所示。脂質(zhì)和類(lèi)脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物類(lèi)別的代謝物數(shù)量最多，約占關(guān)節(jié)滑液總代謝物含量的50%，其中脂質(zhì)和類(lèi)脂質(zhì)分子含量占比30.2%，有機(jī)酸及其衍生物含量占比19.9%。另外，還鑒定到關(guān)節(jié)滑液中含有10.1%有機(jī)雜環(huán)化合物、9.6%苯環(huán)烴類(lèi)、6.9%有機(jī)氧化合物、4.3%苯丙烷和聚酮類(lèi)、2.7%有機(jī)氮化合物、2.7%核苷及核苷類(lèi)似物和13.5%其他化合物。每類(lèi)代謝產(chǎn)物在幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬關(guān)節(jié)滑液樣品中的檢出豐度如圖3D所示。

2.4 雄性比格犬幼年與成年時(shí)期關(guān)節(jié)的代謝差異

單獨(dú)比較雄性幼年犬和成年犬的關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)特征(圖4)。在正、負(fù)離子模式下，分別建立OPLS-DA模型，從圖4A中可以發(fā)現(xiàn)兩組樣品分別緊密聚集到一起，并得到了明顯分離，說(shuō)明兩組樣本中的內(nèi)源性代謝物圖譜存在顯著性差異(圖4A)。為了避免有監(jiān)督模型在建模過(guò)程中發(fā)生過(guò)擬合，我們采用置換檢驗(yàn)(Permutation test)進(jìn)行檢驗(yàn)，以保證模型的有效性。置換檢驗(yàn)使用交叉驗(yàn)證的兩個(gè)參數(shù)R2和Q2進(jìn)行評(píng)價(jià)(R2表示模型的方差大小和擬合的優(yōu)良度，Q2表示模型預(yù)測(cè)值的方差大小和預(yù)測(cè)能力)。正離子模式下OPLS-DA置換檢驗(yàn)顯示R2Y等于0.898，Q2等于0.676；負(fù)離子模式下顯示R2Y為0.97，Q2為0.625，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)能力(圖4B)。

雄性犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)共鑒定出386種代謝物在幼年犬與成年犬中顯著不同(VIP>1,P<0.05)。與幼年犬相比，成年犬關(guān)節(jié)滑液中有93個(gè)代謝物的含量顯著增加，293個(gè)代謝物含量顯著減少(圖4C)。含量水平升高的內(nèi)源性代謝物中，(+)-3-(3,4-亞甲二氧基苯基)-1,2-丙二醇的VIP值最大，其次是異丁酰甘氨酸、高瓜氨酸、白三烯 C4、3-甲氧基-4-羥基苯基乙二醇硫酸鹽和假尿苷等。濃度降低的內(nèi)源性代謝物中，L-哌可酸的VIP值最大，其次是脯氨酸甜菜堿、N(6)-甲基賴(lài)氨酸、7-甲基鳥(niǎo)苷和1-甲基組胺(圖4D)。通路富集分析表明，差異代謝物主要參與組氨酸代謝、精氨酸生物合成、嘧啶代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、D-氨基酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、GABA突觸信號(hào)通路等生理過(guò)程(圖4E)。

注：A.OPLS-DA模型得分圖;B.OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖；圖中橫坐標(biāo)表示置換保留度，即與原模型 Y 變量順序一致的比例，縱坐標(biāo)表示R2和Q2的值。綠色的點(diǎn)表示R2，藍(lán)色的點(diǎn)表示Q2;C.正負(fù)離子模式火山圖;D.顯著性差異代謝物表達(dá)差異柱狀圖;E.KEGG通路富集分析圖

2.5 雌性比格犬幼年與成年時(shí)期關(guān)節(jié)的代謝差異

雌性幼年犬和成年犬的關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)特征見(jiàn)圖5。正、負(fù)離子模式下，OPLS-DA模型判別顯示幼年組和成年組樣本具有高質(zhì)量的區(qū)分度，說(shuō)明內(nèi)源性代謝物圖譜差異明顯(圖5A)。模型置換檢驗(yàn)顯示正離子模式下R2Y等于0.977，Q2等于0.535；負(fù)離子模式下R2Y為0.927，Q2為0.593，說(shuō)明模型擬合度與穩(wěn)健性均良好(圖5B)。

雌性犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)共鑒定到269種代謝物在幼年犬與成年犬中顯著不同(VIP>1,P<0.05)。與幼年犬相比，成年犬關(guān)節(jié)滑液中有143個(gè)代謝物的含量顯著增加，126個(gè)代謝物含量顯著減少(圖5C)。含量水平升高的內(nèi)源性代謝物中，5-磷酸吡哆醛的VIP值最大，其次是戊二酰肉堿、N-乙酰絲氨酸、假尿苷、谷氨酰胺和1-水楊酸葡糖苷酸等。濃度降低的內(nèi)源性代謝物中，1-甲基腺苷的VIP值最大，其次是7-甲基鳥(niǎo)苷、穗花雙黃酮、脯氨酸甜菜堿和7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN-38)(圖5D)。通路富集分析表明，差異代謝物主要參與嘧啶代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、D-氨基酸代謝、礦物質(zhì)吸收、組氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、碳水化合物分解和吸收、蛋白分解和吸收、氨基酰tRAN生物合成的生理過(guò)程(圖5E)。

2.6 雌性與雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中關(guān)節(jié)滑液的代謝特征

將雌、雄性比格犬關(guān)節(jié)滑液中鑒定到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，從幼年到成年過(guò)程中，在雌性和雄性中共同上調(diào)的代謝物有18種，包括順式-烏頭酸、α-酮戊二酸、乳清酸核苷-5-單磷酸、胸腺嘧啶等，雄性特異性上調(diào)的代謝物有24種，雌性特異性上調(diào)的代謝物有34種(圖6A，B)。雌性和雄性中共同下調(diào)的代謝物有30種，包括1-甲基-L-組氨酸、2′-脫氧胞苷、胞嘧啶-5-三磷酸、D-麥芽糖等，雄性特異性下調(diào)的代謝物有73種，雌性特異性上調(diào)的代謝物有11種(圖6C，D)。綜上可以看出，從幼年到成年的發(fā)育過(guò)程中，雌性比格犬和雄性比格犬關(guān)節(jié)代謝的共同產(chǎn)物有48種，提示這些產(chǎn)物可能是關(guān)節(jié)發(fā)育的潛在標(biāo)志物，精準(zhǔn)的標(biāo)志物確定有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

注：A、C.雌、雄性比格犬代謝物聯(lián)合分析韋恩圖；B.雌、雄性共同上調(diào)代謝物熱圖；D.雌、雄性共同下調(diào)代謝物熱圖

3 討論

機(jī)體的基礎(chǔ)代謝會(huì)隨著生物體發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)改變，從而引起小分子代謝物的種類(lèi)、濃度、比例等發(fā)生變化，最終造成個(gè)體間代謝圖譜的差異[8]。代謝組學(xué)通過(guò)分析生物樣本中可以反映機(jī)體狀況的小分子內(nèi)源性代謝物，對(duì)發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行整體評(píng)價(jià)[8]。本研究采用UHPLC-Q-TOF MS檢測(cè)手段對(duì)比格犬關(guān)節(jié)滑液進(jìn)行測(cè)定，以代謝組學(xué)為分析途徑，研究犬關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中的代謝特征。結(jié)果表明，雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中，組氨酸代謝、精氨酸合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)分解和吸收、礦物質(zhì)吸收等過(guò)程產(chǎn)生的代謝物減少；雌性比格犬中參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、組氨酸代謝、碳水化合物分解和吸收過(guò)程的代謝物減少，說(shuō)明幼年比格犬骨關(guān)節(jié)代謝氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及碳水化合物的能力旺盛。此外，我們還發(fā)現(xiàn)比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中有48種代謝物含量發(fā)生顯著性改變，可能是犬關(guān)節(jié)發(fā)育的生物標(biāo)志物。

骨骼由骨基質(zhì)和骨礦質(zhì)組成，骨基質(zhì)主要由氨基酸構(gòu)成，其對(duì)骨骼的形態(tài)、大小和柔韌度起到?jīng)Q定性作用；骨礦質(zhì)主要由鈣構(gòu)成，影響骨骼的致密度和堅(jiān)硬度[9]。氨基酸是各種礦物質(zhì)和微量元素的“搬運(yùn)工”，鈣、鐵、鋅、硒等各種礦物質(zhì)和微量元素需要氨基酸和蛋白質(zhì)將它們搬送到機(jī)體各處[10]。氨基酸除了具有促進(jìn)骨骼發(fā)育的作用，還有保護(hù)骨骼的功能。例如，精氨酸代謝生成的NO能緩解炎性反應(yīng)與風(fēng)濕癥，對(duì)肌腱、關(guān)節(jié)的炎癥和疼痛具有消炎、緩解以及修復(fù)受損細(xì)胞與組織的功效[11]；組氨酸代謝能夠有效防治類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]。

骨骼中70%～80%的有機(jī)物屬于膠原蛋白，膠原蛋白有助于骨骼及軟骨的生長(zhǎng)，保持骨骼和肌肉的彈性[13]。補(bǔ)充膠原蛋白可以促進(jìn)關(guān)節(jié)潤(rùn)滑、防震、減少關(guān)節(jié)軟骨磨損，從而延緩關(guān)節(jié)退行性改變，減輕臨床不適癥狀等[14]。

碳水化合物是機(jī)體主要的供能物質(zhì)，不可缺少。優(yōu)質(zhì)的碳水化合物對(duì)機(jī)體有保護(hù)和促進(jìn)作用，如體質(zhì)量控制、代謝健康、消化道健康等[15]。但也有研究認(rèn)為飲食中的碳水化合物會(huì)引起骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病[16]。然而，并不是不攝入碳水化合物才是健康的模式，而是提倡攝入平衡的碳水化合物，可以通過(guò)飲食中碳水化合物、膳食纖維、糖的比例，來(lái)判斷飼糧是否含有健康的碳水化合物[17]。

綜上，通過(guò)對(duì)犬關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)研究，系統(tǒng)揭示了犬關(guān)節(jié)代謝的特征，以便針對(duì)性地對(duì)幼年犬和成年犬的飼糧營(yíng)養(yǎng)配比進(jìn)行優(yōu)化，有助于幼年犬關(guān)節(jié)正常發(fā)育和成年犬的關(guān)節(jié)養(yǎng)護(hù)。