寧夏人腺病毒臨床標(biāo)本的首次全基因組序列分析

李宗倍，朱 亮，王新寧，吳忠蘭

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏疾病預(yù)防控制中心，銀川 750000；4.寧夏銀川市金鳳區(qū)疾病預(yù)防控制中心，銀川 750000）

人腺病毒屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，是無包膜的雙鏈DNA病毒[1]。人腺病毒全基因組長約36 kb，在感染后的不同時間轉(zhuǎn)錄，生成早期（E）、中期（I）和晚期（L）區(qū)域轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[2]。目前，已知的腺病毒都呈二十面體結(jié)構(gòu)，由7個不同的衣殼蛋白組成，包括3種主要衣殼蛋白（六鄰體、五鄰體以及纖維蛋白）和4種次要衣殼蛋白（Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ）[3]。截至目前，腺病毒可劃分為7個亞屬（A～G），包括111個基因型，其中人腺病毒C亞屬包括HAdV-C1、HAdV-C2、HAdV-C5、HAdVC6、HAdV-C57、HAdV-C89、HAdV-C1047個基因型。

人腺病毒是導(dǎo)致多種人類疾病的常見病原體，如急性呼吸道疾病、結(jié)膜炎、胃腸炎、泌尿系感染和腦膜腦炎等[4]。腺病毒占兒童呼吸道感染的2%～15%[5-8]，并且呈逐年升高的趨勢[9]。人腺病毒B（HAdV-B3、7、11、14、16、21和55）、C（HAdVC1、2、5和6）和E（HAdV-E4）亞屬通常與急性呼吸道疾病有關(guān)，HAdV-C是幼兒急性呼吸道感染的主要病原體[10]。

2020年，在寧夏中衛(wèi)市海原縣1例核酸檢測陰性的發(fā)熱患兒咽拭子標(biāo)本中檢測到人腺病毒。本課題組對此標(biāo)本進(jìn)行全基因組測序，并對其進(jìn)行進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本來源于2020年2月寧夏中衛(wèi)市海原縣1例有發(fā)熱癥狀、新冠肺炎篩查時核酸檢測陰性的2歲幼兒的咽拭子標(biāo)本。該患兒體溫38.5℃，血常規(guī)：白細(xì)胞（WBC）12.37×109/L，淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYMPH）4.70×109/L，淋巴細(xì)胞百分比38.0%，CT提示雙肺未見實(shí)變影。

1.2 試劑與儀器

核酸磁珠法快速提取試劑盒（江蘇碩世生物科技股份有限公司），呼吸道腺病毒核酸檢測試劑盒（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司），核酸提取儀器為江蘇碩世全自動核酸提取儀，PCR擴(kuò)增儀為ABI 7500 Fast。

1.3 標(biāo)本核酸檢測

按照核酸快速提取試劑盒（磁珠法）說明書，取200μL標(biāo)本提取病毒核酸。按照呼吸道腺病毒核酸檢測試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。

1.4 全基因組序列測定

取600μL臨床標(biāo)本送至上海伯杰醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行全基因組測序，并拼接成1條完整序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

先將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，初步判定型別。再從美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）下載HAdV-C原始株和代表株[11]。使用MAFFT[12]（版本號7.490）進(jìn)行多序列比對。使用trimAl[13]（版本號1.2）對多序列比對結(jié)果進(jìn)行過濾。使用BioEdit（版本號7.0.9.1）進(jìn)行同源性分析。使用MEGA（版本號7.0）構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000。使用SplitsTree[14]（版本號4.18.2）默認(rèn)設(shè)置構(gòu)建全基因組網(wǎng)狀進(jìn)化樹。使用Simplot[15]（版本號3.5.1）進(jìn)行重組分析，窗口大小設(shè)置為5 000，步長設(shè)置為100。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果

對該幼兒咽拭子標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果顯示人腺病毒核酸DNA陽性（CT值為21.11），證明該咽拭子標(biāo)本為腺病毒陽性。

2.2 核酸序列的同源性分析

該咽拭子標(biāo)本全基因組長度為35 965 bp，基因組G+C的含量為55.22%。分別與人腺病毒C亞屬7個原始株進(jìn)行全基因組比較，同源性分析結(jié)果見表1，與HAdV-C1、2、5、6、57、89、104的同源性分別為95.2%、99.5%、94.5%、97.0%、96.5%、98.5%、98.3%。該標(biāo)本全基因組與HAdV-C2原始株同源性最高。

表1 寧夏標(biāo)本全基因組與人腺病毒C亞屬原始株全基因組的同源性比較

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

Ningxia2020腺病毒全基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明，Ningxia2020腺病毒與HAdV-C2聚為一類（圖1）。五鄰體、六鄰體和纖維蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明，這3個主要抗原基因分別屬于P104（圖2）、H2（圖3）和F104（圖4）。

圖1 基于全基因組的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖2 基于五鄰體基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 基于六鄰體基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖4 基于纖維蛋白基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 基因進(jìn)化分析

SplitsTree全基因組網(wǎng)狀進(jìn)化樹結(jié)果顯示，Ningxia2020腺病毒位于HAdV-C2進(jìn)化分支內(nèi)，且與MF315028.1株腺病毒存在高度相似進(jìn)化關(guān)系（圖5）。

圖5 基于全基因組構(gòu)建的HAdV-C網(wǎng)狀進(jìn)化樹

2.5 基因重組分析

Simplot軟件Bootscan重組分析結(jié)果顯示，HAdV-C89原始株可能在nt9000～12000參與了重組，HAdV-C104原始株可能在nt12000～16000（其中包括Penton基因）和Fiber基因發(fā)生重組，HAdV-C2原始株可能在nt16000～30000（其中包括Hexon基因）發(fā)生了重組，表明Ningxia2020腺病毒基因組包含多個型內(nèi)重組事件。與45株國內(nèi)外代表株進(jìn)一步分析顯示，Ningxia2020株在nt14000～30000包含MF315028.1株的基因區(qū)域（其中包括Peton和Hexon基因區(qū)域），而Fiber基因區(qū)域?yàn)镸K041236.1株的基因片段，在nt1～13000與45株代表株差異較大，提示該區(qū)域可能發(fā)生了重組，但來源未知，見圖6。

圖6 Ningxia2020株人腺病毒全基因組序列重組分析

3 討論

2020年寧夏中衛(wèi)市海原縣患兒感染的腺病毒標(biāo)本全基因組的G+C含量為55.22%，與人腺病毒C亞屬其他病原G+C含量相似[16]。該標(biāo)本與人腺病毒C亞屬7個原始株同源性均＞90%，說明該患兒感染的病原很可能是人腺病毒C亞屬。同源性分析結(jié)果顯示，該標(biāo)本與人腺病毒C亞屬2型同源性最高（99.5%）。

Hexon基因位于晚期轉(zhuǎn)錄基因L3上，六鄰體由五面體底座和三角形塔區(qū)組成，塔區(qū)有4個環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Loop1～Loop4），Loop1上有6個高變區(qū)，Loop2上有1個高變區(qū)，這7個高變區(qū)有屬特異性α抗原[17]，基于高變區(qū)，六鄰體基因是腺病毒分類中最常用的基因。Hexon系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，Ningxia2020標(biāo)本與1953年美國分離得到的HAdV-C2原始株非常相似。Fiber基因位于晚期轉(zhuǎn)錄基因L5上，纖維蛋白結(jié)構(gòu)包括球部、中軸和尾部3部分，纖突球部有型特異性抗原，是人腺病毒分型依據(jù)的主要區(qū)域[18]?；贔iber構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹提示，2020年寧夏咽拭子標(biāo)本與HAdV-C104在同一支內(nèi)。位于二十面體頂端的12個殼粒組成五鄰體，每個五鄰體包括基底部分和伸出表面的纖突，基底部分有屬特異性β抗原[18]。Penton base進(jìn)化樹中，Ningxia2020標(biāo)本與HAdV-C2原始株在不同分支，但和HAdV-C104原始株聚在一起。全基因組進(jìn)化樹結(jié)果顯示，本研究標(biāo)本與HAdV-C2原始株聚為一類。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果表明，Ningxia2020腺病毒可能發(fā)生了重組。進(jìn)一步網(wǎng)狀進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，此株腺病毒與2012年11月從北京某醫(yī)院患有支氣管炎的患兒中分離到的毒株密切相關(guān)，具有相似的進(jìn)化歷史。

Simplot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了此株腺病毒是重組毒株，并且提示包含HAdV-C2、HAdV-C89和HAdV-C104多個型內(nèi)重組。Hexon基因?yàn)镠AdVC2，Penton和Fiber基因?yàn)镠AdV-C104，與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果一致。與其余45株代表株的進(jìn)一步分析表明，此株腺病毒五鄰體和六鄰體兩個主要抗原蛋白基因區(qū)域均為human/CHN/BJ04/2012這株腺病毒基因，與網(wǎng)狀進(jìn)化樹的結(jié)果相互印證。

嬰幼兒群體對腺病毒的免疫水平較低[19]，是人腺病毒的易感人群。腺病毒占兒童呼吸道感染的比例高達(dá)15%[8]。兒童重癥肺炎癥狀嚴(yán)重且預(yù)后不良，且目前只有對癥治療。人腺病毒C亞屬是嬰幼兒呼吸道感染的主要病原體之一，并且HAdV-C的頻繁重組[16，20-21]可能改變致病力，因此需要加強(qiáng)腺病毒分子流行病學(xué)監(jiān)測。

本研究是寧夏人腺病毒臨床標(biāo)本的首次全基因組進(jìn)化報道，有助于了解寧夏人腺病毒的流行基因型，為腺病毒的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)，同時也進(jìn)一步補(bǔ)充了我國流行HAdV-C的分子基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。