基于小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組的免疫相關(guān)基因發(fā)掘

李潔瓊

（新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物科技分院，新疆 昌吉 831100）

昆蟲不具備適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，依賴多種先天防御反應(yīng)對(duì)抗入侵的病原體和寄生蟲，這些反應(yīng)包括使用物理屏障以及局部和全身的先天免疫反應(yīng)［1，2］。同時(shí)昆蟲體內(nèi)存在的強(qiáng)大抗菌免疫系統(tǒng)可以作為第二道防線發(fā)揮作用，主要基于抗菌肽，但也包括絲氨酸蛋白酶、應(yīng)激因子和參與調(diào)理和凝血的因子［3，4］。與其他生理過程一樣，昆蟲免疫反應(yīng)涉及傳感器（sensor）、效應(yīng)器（effector）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器（signal transducer），將病原體識(shí)別與細(xì)胞免疫反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)聯(lián)系起來［5-7］。因此，昆蟲細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于介導(dǎo)昆蟲的免疫反應(yīng)是非常重要的。受體介導(dǎo)的Toll、IMD、MAPK-JNK-p38、JAKSTAT 等免疫信號(hào)通路進(jìn)化保守，作為體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑和介質(zhì)發(fā)揮著重要的作用［8-10］。

對(duì)果蠅（Drosophila melanogaster）的研究表明，真菌、革蘭氏陽性細(xì)菌往往是借助果蠅體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)作用，水解活化細(xì)胞因子Sp?tzle 最終觸發(fā)Toll 通路［11，12］。被激活的細(xì)胞因子Sp?tzle 能夠高度結(jié)合Toll 受體，借助Dorsal、Dif 等NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活因子，作用和調(diào)控體內(nèi)的免疫效應(yīng)物基因的表達(dá)水平，促進(jìn)抗菌肽加速合成。在這一過程中還會(huì)逐步分化血細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有包裹作用的層狀細(xì)胞，可以殺滅寄生蟲、病原體［13］。當(dāng)發(fā)現(xiàn)或感知到革蘭氏陰性細(xì)菌時(shí)，DAP 型肽聚糖可以快速通過信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)、跨膜受體PGRP-LC 開啟IMD 信號(hào)通路，活化的Relish（NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活因子）也會(huì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)另一組免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［14，15］。而且，果蠅體內(nèi)有很多能夠激發(fā)MAPK-JNK-p38 通路的物質(zhì)，如應(yīng)激信號(hào)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，并對(duì)細(xì)胞凋亡、分化和IMD 通路起到調(diào)節(jié)作用［16，17］。此外，JAK-STAT 通路、RNA 干擾以及自噬同樣也會(huì)介入抗病毒免疫反應(yīng)［18］。根據(jù)現(xiàn)有信息，這些途徑在模式昆蟲和非模式昆蟲中基本保守，但也存在明顯的差異。報(bào)道顯示，意蜂（Apis mellifera）的各類免疫基因并不是很多［19］。例如，果蠅中已發(fā)現(xiàn)9 個(gè)不同的Toll 基因，但是意蜂卻僅為5 個(gè)［19］。相較于果蠅，豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）尚未找到完整、統(tǒng)一的IMD 途徑［20］。在昆蟲綱中，部分基因組已發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因在不同物種中是有區(qū)別的。因此，有必要分析在不同的昆蟲中，是否存在完整的免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路以及免疫信號(hào)通路組分的進(jìn)化是否保守。

昆蟲生存的微環(huán)境豐富多樣，對(duì)不同類別的昆蟲來說，其響應(yīng)低溫、病原微生物等脅迫的分子機(jī)制有顯著差異。鞘翅目擬步甲科昆蟲小胸鱉甲（Microdera punctipennis），廣泛地分布于新疆地區(qū)的古爾班通古特沙漠，是生存于北部荒漠的優(yōu)勢(shì)物種之一，也是新疆特有物種［21］，在抵抗荒漠環(huán)境時(shí)具有自身的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)［22］。小胸鱉甲這種對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的差異需要從基因整體表達(dá)的角度開展全面研究。所以，本研究以小胸鱉甲為試驗(yàn)對(duì)象，樣本采集選擇在越冬地點(diǎn)進(jìn)行，并分別對(duì)越冬的成蟲、實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的成蟲和實(shí)驗(yàn)室低溫脅迫的成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［23-25］，最終建立低溫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得小胸鱉甲基因整體表達(dá)的情況。

目前缺乏對(duì)小胸鱉甲分子免疫機(jī)制的研究。為觀察小胸鱉甲自身的免疫功能在低溫環(huán)境下發(fā)生哪些變化，人們先要了解它的免疫系統(tǒng)，對(duì)比、判斷與其他模式昆蟲是否存在不同之處。目前昆蟲防御機(jī)制的基因組分析表明，病原體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的中心是識(shí)別真菌、細(xì)菌和病毒所引發(fā)的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路可導(dǎo)致效應(yīng)分子的產(chǎn)生［8］，因此，本研究利用小胸鱉甲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)首次注釋和篩選了小胸鱉甲的免疫相關(guān)基因，包括編碼模式識(shí)別受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控因子、免疫效應(yīng)因子等。分別對(duì)小胸鱉甲潛在的模式識(shí)別受體蛋白完成有序的篩選；對(duì)Toll、IMD、MAPK-JNK-p38 以及JAK-STAT 免疫通路，以及自噬、凋亡還有RNA 干擾等免疫相關(guān)的細(xì)胞過程進(jìn)行全面的分析；并對(duì)溶菌酶、抗菌肽、幾丁質(zhì)酶、熱休克蛋白、酚氧化酶以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等免疫效應(yīng)物做出注釋。結(jié)合篩選得到的免疫相關(guān)基因繪制小胸鱉甲免疫通路圖，建立小胸鱉甲的免疫系統(tǒng)架構(gòu)。此研究成果為進(jìn)一步明確昆蟲免疫調(diào)控與抗寒機(jī)制的內(nèi)在聯(lián)系奠定可靠的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、處理及測(cè)序

小胸鱉甲成蟲采自古爾班通古特沙漠南部，阜康市222 團(tuán)（44°24′ N，87°51′ E，海拔444 m），于實(shí)驗(yàn)室（30 ℃）飼養(yǎng)。4 只越冬成蟲于2016年1月11日采集（組名為Mp_W），置于液氮內(nèi)保存。采樣點(diǎn)土壤溫度-8.8 ℃，濕度4.98%。在飼養(yǎng)得到的成蟲中選取個(gè)體相似的3 只作為對(duì)照組試蟲（組名為Mp_30）。此外，取3 只飼養(yǎng)的成蟲于-4 ℃低溫脅迫處理3 h（組名為Mp_4）。-4℃處理組、越冬組、對(duì)照組，全部通過Illumina HiSeq?4000 測(cè)序儀來完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

為補(bǔ)充低溫處理的數(shù)據(jù)，再次將3 只飼養(yǎng)的成蟲作為對(duì)照組試蟲（組名為CK），另取3 只飼養(yǎng)的成蟲于4 ℃低溫脅迫處理3 h（組名為CD），通過測(cè)序儀完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)已上載至生物技術(shù)信息中心（NCBI），利用BioProject 號(hào)PRJNA345299 即可完成下載。

1.2 原始序列拼接組裝

基于Novogene 內(nèi)部的Perl 腳本，進(jìn)行測(cè)序raw reads 的預(yù)處理。將adapter、低質(zhì)量reads（摻雜多聚-N）予以去除，留下clean reads。通過Trinity（r20140413p1）軟件進(jìn)行clean reads 的拼接得到contig，然后進(jìn)行contig 聚類組裝，從中選取最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene。除參數(shù)min_kmer_covfor 設(shè)為2 外，各參數(shù)均為0。

1.3 unigene 功能注釋和分類

基于blastx 算法（E-value＜10-5），將unigene 與Refseq Insect Protein、Refseq Insect RNA、NCBI Nr、NCBI Nt、Swiss-Prot、基因本位GO、京都基因與基因組百科全書KEGG 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的已知序列做比較，根據(jù)序列相似性，可以對(duì)照注釋轉(zhuǎn)錄組中unigene 的功能。若同個(gè)unigene 在不同的庫中注釋結(jié)果不一致，則參照最佳命中（best hit）結(jié)果來確定基因的生物學(xué)功能。使用軟件Blast2go 預(yù)測(cè)各序列功能及其GO 分類，使用KAAS（KEGG auto annotation server）預(yù)測(cè)KEGG 代謝通路。

1.4 重要免疫相關(guān)基因的篩選和比較

基于基因比對(duì)注釋的信息，并參照果蠅［9，11-14，16，17］、家蠶［26］、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）［27］、煙草天蛾［5，28］等昆蟲物種中已報(bào)道的相關(guān)知識(shí)，采用人工識(shí)別的方法從小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組序列中識(shí)別篩選出與免疫信號(hào)途徑有關(guān)的基因序列，尤其MAPK、Toll、IMD、JAK-STAT、RNAi、凋亡和自噬等信號(hào)通路。利用Trinity 的CDS 軟件來完成蛋白編碼序列（Protein coding sequence，CDS）的預(yù)測(cè)。根據(jù)上述結(jié)果，篩選免疫相關(guān)基因，同時(shí)繪制小胸鱉甲的免疫通路圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于昆蟲數(shù)據(jù)庫的小胸鱉甲測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝及功能注釋

為了充分獲取小胸鱉甲低溫轉(zhuǎn)錄組中潛在的昆蟲免疫相關(guān)基因序列，本研究收集以小胸鱉甲為材料測(cè)序的所有RNA-Seq 數(shù)據(jù)（表1），包括來自冬季樣本的4 組數(shù)據(jù)（Mp_W），30 ℃飼養(yǎng)成蟲對(duì)照組樣本的3 組數(shù)據(jù)（Mp_30），-4 ℃3 h 處理樣本的3 組數(shù)據(jù)（Mp_4），4 ℃3 h 處理樣本的1 組數(shù)據(jù)（3 只昆蟲數(shù)據(jù)合并）（CD）和25 ℃飼養(yǎng)成蟲的1 組數(shù)據(jù)（3 只昆蟲數(shù)據(jù)合并）（CK）。

表1 小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

4 個(gè)越冬組樣本、3 個(gè)-4 ℃組樣本和3 個(gè)對(duì)照組均是利用De novo 組裝、Trinity 拼接，得到的平均長(zhǎng)度為635 bp，N50 為1 007 bp 的198 206 個(gè)小胸鱉甲u(yù)nigene（表2）。4 ℃處理組與對(duì)照組樣本總共得到79 725 244 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，約為31 741 條unigene，其長(zhǎng)度平均為1 019 bp，N50 為1 958 bp。

將小胸鱉甲u(yù)nigene 與NCBI nr 庫內(nèi)的123 種昆蟲基因數(shù)據(jù)進(jìn)行序列同源性對(duì)比，共發(fā)現(xiàn)49 034 個(gè)unigene（占24.74%）與已知的其他昆蟲蛋白具有不同程度的同源性（表3）。在小胸鱉甲已注釋的序列中，有9 650 個(gè)（E-value = 0）unigene 是完全匹配的，占注釋序列總數(shù)的19.68%（圖1a）。分析對(duì)比同源性序列一致的物種，共9 522 個(gè)unigene（占19.42%）和模式昆蟲赤擬谷盜存在高度同源性（圖1b）。

圖1 小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組unigene 與NCBI的nr 庫昆蟲數(shù)據(jù)的比對(duì)結(jié)果

表3 小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)在公共數(shù)據(jù)庫中的基因注釋統(tǒng)計(jì)

2.2 小胸鱉甲免疫相關(guān)基因的篩選與分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和功能注釋的結(jié)果中，共篩選得到小胸鱉甲的107 個(gè)免疫相關(guān)基因及其同源unigene 1 750 個(gè)，分為識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控、效應(yīng)分子3 大類（表4）。

小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中篩選出16 種模式識(shí)別受體，其中，vitellogenin最多，有75 個(gè)unigene；篩選出昆蟲調(diào)制因子（Modulator）相關(guān)的352 個(gè)unigene，其中包括絲氨酸蛋白酶SP 基因的同源unigene 112 個(gè)（表4）。另外，有13 個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin 基因同源unigene。

昆蟲Toll 信號(hào)通路的組分是高度保守的，與果蠅相比，小胸鱉甲的Toll 通路是完整的，具有編碼胞外細(xì)胞因子sp?tzle、跨膜受體Toll、激酶pelle 和NFκB 轉(zhuǎn)錄因子dorsal等基因（表4，圖2）。

圖2 小胸鱉甲Toll免疫信號(hào)通路及其調(diào)控

圖3 顯示小胸鱉甲IMD 通路基因包含了TAK1、TAB2、Dredd、Ird5、Relish（Rel）、Effete等。與果蠅IMD 通路相比，小胸鱉甲缺失的IMD 通路基因包括IMD、kenny和FADD。IMD 通路也分支到JNK 通路和細(xì)胞凋亡通路，圖3a 顯示，JNK 通路是IMD 通路的一個(gè)分支，共享一些上游調(diào)控基因，包括TAK1、TAB2 和IRD5；圖3b 顯示，JNK 通路與p38MAPK 通路共同激活下游基因——核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Jra/Fos，增強(qiáng)特定基因的轉(zhuǎn)錄。此外，還有2 種血小板衍生和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子PVF 及其受體PVR，可以和小GTP 酶Ras85D 共同作用激活JNK 通路（圖3b）。同時(shí)MLK1 和MKK4 也參與到JNK 途徑的激活。

圖3 小胸鱉甲IMD-JNK 與MAPK-JNK-p38 免疫信號(hào)通路及其調(diào)控

圖4 顯示小胸鱉甲具有JAK-STAT 通路的核心基因，包括編碼JAK 酪氨酸激酶（Hopscotch）和STAT 因子的基因，與果蠅相比，小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中未找到與跨膜受體Dome（domeless）、配體Upd（unpaired）同源的基因（表4，圖4a）。介入調(diào)節(jié)免疫的RNAi 途徑有3 種，分別為piRNA、miRNA、siRNA。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中注釋到dicer（Dcr）、Belle、argonaut（Ago）以及Vig基因，如siRNA 核心基因Dcr-2、Ago-2，以及miRNA 和piRNA 的核心基因Ago-1和Ago-3（表4，圖4b）。在小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)到參與調(diào)控整個(gè)自噬過程的自噬相關(guān)基因（Autophagy-related gene，Atg）的同源unigene，分別為Atg1、Atg2、Atg5、Atg8、Atg9、Atg13、Atg16，還有5 個(gè)磷脂酰肌醇3-激酶PI3K、6 個(gè)蛋白激酶AKT、8 個(gè)蛋白激酶TOR基因的同源unigene（表4，圖4c）。同時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞凋亡過程中重要的5 個(gè)基因，包括sickle、IAP1（Inhibitor of apoptosis）、Dronc（caspase-5）、Dredd（caspase-6）以及hid（編碼IAP 拮抗劑）（表4，圖4d）。

圖4 小胸整甲JAK-STAT（a）、RNAi（b）、自噬（c）與凋亡（d）免疫信號(hào)通路及其調(diào)控

對(duì)免疫效應(yīng)因子對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行初步注釋、篩選后，發(fā)現(xiàn)小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中共有558 個(gè)免疫效應(yīng)因子基因的同源unigene（表4），包括抗菌肽、溶菌酶、幾丁質(zhì)酶、熱休克蛋白、酚原氧化酶（PPO）以及酚氧化酶（PO）等。此外，還具有涉及調(diào)控自由基的多種抗氧化酶，包括過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、NADPH 氧化酶、一氧化氮合酶、硫氧還蛋白還原酶、硫醇抗氧化酶等（表4）。

表4 小胸鱉甲主要免疫基因

續(xù)表4

續(xù)表4

2.3 小胸鱉甲免疫信號(hào)通路

參照模式昆蟲果蠅、家蠶、赤擬谷盜和煙草夜蛾的研究結(jié)果，繪制小胸鱉甲的免疫通路（圖5），囊括了小胸鱉甲中編碼模式識(shí)別受體、免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控因子和免疫效應(yīng)因子的免疫相關(guān)基因，及Toll、IMD、MAPK-JNK-p38 和JAK-STAT 免疫通路、RNAi機(jī)制、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡過程中的免疫相關(guān)基因。

圖5 小胸鱉甲的免疫通路

3 討論

昆蟲免疫系統(tǒng)由各種細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)組成，這些免疫成分具有多種組合形式來對(duì)抗病原體和其他有害物質(zhì)［8，15］。為明確感染的分子機(jī)制，有必要對(duì)免疫反應(yīng)的參與基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。遺憾的是，目前的研究結(jié)果仍未將昆蟲免疫相關(guān)基因做出細(xì)致的分類。本研究開展對(duì)昆蟲小胸鱉甲免疫系統(tǒng)的分析，為了構(gòu)建小胸鱉甲免疫庫，并在其免疫系統(tǒng)的多種免疫反應(yīng)過程中呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的分類，通過比對(duì)同源序列和GO 分類，結(jié)合手工篩選，共完成小胸鱉甲100 個(gè)免疫相關(guān)基因的注釋。本研究是參考其他學(xué)者研究的昆蟲免疫相關(guān)蛋白基礎(chǔ)上來進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋［8，15］，包括果蠅［9，11-14，16，17］、家蠶［26］、赤擬谷盜［27］以及煙草天蛾［5，28］等昆蟲。除了直接編碼昆蟲免疫蛋白的基因外，還有其他特定的基因可以參與免疫反應(yīng)，盡管有許多差異表達(dá)的調(diào)節(jié)因子與應(yīng)激反應(yīng)重疊而不是由免疫攻擊引起的［29］，但是理論上免疫攻擊后差異調(diào)節(jié)的基因都可能具有免疫功能。因此，本研究基于序列同源性和文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建了小胸鱉甲免疫系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路圖，其中，對(duì)病原體進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別是引發(fā)免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)：PRR 識(shí)別結(jié)合入侵病原體的PAMP，它們直接或者在絲氨酸蛋白酶介導(dǎo)的酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)后，觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活，進(jìn)而激活抗微生物防御機(jī)制，如抗菌肽的表達(dá)、RNAi、自噬以及凋亡等；有些還會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，將入侵者吞噬，發(fā)生包囊、集結(jié)并伴隨黑化反應(yīng)［15］。

昆蟲免疫系統(tǒng)可與環(huán)境和微生物共同進(jìn)化從而達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，在進(jìn)化過程中，一些免疫相關(guān)基因?yàn)榱藵M足生物的生理需求變化，適應(yīng)新的外界環(huán)境，會(huì)以適應(yīng)、復(fù)制及丟失等形式做出應(yīng)對(duì)反應(yīng)［15］。目前在果蠅［9，11-14，16，17］、家蠶［26］、豌豆蚜［20］以及煙草天蛾［5，28］等不同類別的昆蟲中，已檢測(cè)出很多免疫相關(guān)基因。岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）基因組中有335 個(gè)免疫相關(guān)基因，與埃及伊蚊（Aedes aegypti）的353 個(gè)在基因數(shù)目上相似，但研究認(rèn)為，與其他基因相比，免疫相關(guān)基因具有更高的進(jìn)化速率［30］。從基因的個(gè)數(shù)、基因家族方面進(jìn)行比較，岡比亞按蚊與果蠅的基因組也十分相似，僅在抗菌肽基因家族中存在差異［31］。對(duì)比5 種昆蟲的基因組［32］，家蠶具有218 個(gè)免疫相關(guān)基因，與果蠅、赤擬谷盜數(shù)目相似，與意蜂的139 個(gè)免疫相關(guān)基因數(shù)目則具有較大的差異。另外，意蜂的免疫相關(guān)基因數(shù)量與果蠅相比，僅占50%，表明意蜂的免疫機(jī)制可能與其他幾種昆蟲存在較大差異［19，32］。類似的，將小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中編碼病原體識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控以及效應(yīng)蛋白的107 個(gè)免疫相關(guān)基因，與其他昆蟲進(jìn)行分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)編碼模式識(shí)別受體和效應(yīng)蛋白的基因在不同物種中顯示出更高水平的類群特異性［19，20，26-28，30-32］，而信號(hào)傳導(dǎo)通路基因的進(jìn)化相對(duì)保守，變異程度較低［33］。

小胸鱉甲并未開展全基因組測(cè)序研究，故轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)De novo 組裝獲得的246 648 個(gè)unigene 中，難免會(huì)有冗余現(xiàn)象。同時(shí)，多數(shù)屬于未注釋完成、功能模糊的unigene，許多基因可能分布于基因組內(nèi)，但因?yàn)檠b配或注釋錯(cuò)誤導(dǎo)致未精準(zhǔn)識(shí)別［34］。所以本研究初步建立的小胸鱉甲免疫防御通路網(wǎng)絡(luò)后續(xù)還需要進(jìn)行深入的驗(yàn)證、補(bǔ)充、豐富。

3.1 模式識(shí)別受體

通過模式識(shí)別受體蛋白PRR，昆蟲能夠識(shí)別分布于病原體表面的模式分子PAMP［15，35］，進(jìn)而激活體液、細(xì)胞免疫來應(yīng)答不同的病原體［35］。因此昆蟲識(shí)別和結(jié)合不同PAMP 的PRR，也具有不同的結(jié)構(gòu)和功能［15，35］。PRR 識(shí)別并結(jié)合病原體的PAMP 后，激活Toll 等信號(hào)通路，誘導(dǎo)合成抗菌蛋白發(fā)揮作用，或引發(fā)酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而使分解蛋白作用活化，并伴隨著黑化反應(yīng)，最終發(fā)揮清除病原體的作用，這類的PRR 包括肽聚糖識(shí)別蛋白（PGRP）［36］、β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白（βGRP）［37］、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（GNBP）［3，38］、C 型凝集素（CTL）［39］和載脂蛋白（ApoLp）［40］等。有些PRR 可啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過合成和分泌一系列炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)病原體與血細(xì)胞結(jié)合形成集結(jié)或包囊，并調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬入侵者，如CTL、ApoLp、半乳糖凝集素（galectin）［41］、含硫酯鍵蛋白（TEP）［42］、Nimrod 超級(jí)家族［43］和唐氏綜合癥細(xì)胞黏附分子（Dscam）［44］、清道夫受體（SR 和Croquemort）［45］、整聯(lián)蛋白（Integrin）［46］和卵黃蛋白原（vitellogenin）［47］等。在昆蟲的PRR 中，纖維蛋白原相關(guān)蛋白（FREP）還可參與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，介導(dǎo)活性氧的釋放［48］；另外，Draper 作為巨噬細(xì)胞中重要的損傷受體，也可在昆蟲損傷修復(fù)、防御病原體和細(xì)胞自噬等免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［49］。

3.2 免疫信號(hào)通路

3.2.1 調(diào)制因子 小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中SP、persephone和SPH（trypsin、chymotrypsin 和elastase）基因編碼的蛋白可作為調(diào)制因子，參與昆蟲病原體識(shí)別、信號(hào)中繼/調(diào)節(jié)和執(zhí)行機(jī)制，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［50］。昆蟲PRR 識(shí)別病原體PAMP 后激活血漿中SP 和SPH，介入2 條免疫通路，第一條，激活胞內(nèi)酚氧化酶原proPO，從而得到能夠氧化酚類分子的PO，由于PO 的作用，傷口、病原體周圍會(huì)產(chǎn)生黑色素引發(fā)黑化反應(yīng)；第二條，血淋巴中具有Clip 結(jié)構(gòu)域的SP 和SPE（Sp?tzle-processing enzyme），在活化Sp?tzle 蛋白后，再與膜受體Toll 蛋白結(jié)合，激活Toll通路并促進(jìn)attacin、cecropin、gloverin 等抗菌蛋白的合成［50］。另外在小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中注釋到13 個(gè)serpin基因的同源unigene。serpin 超家族大部分都具有抑制絲氨酸蛋白酶（SP）的作用，可與絲氨酸蛋白酶結(jié)合形成共價(jià)復(fù)合物，確保了瞬時(shí)、集中的防御反應(yīng)［51］。

3.2.2 免疫信號(hào)通路及其調(diào)控

1）Toll 通路及其調(diào)控。小胸鱉甲Toll 信號(hào)通路是保守的。PGRP、GNBP 將病原體識(shí)別出來的過程中會(huì)同步向Persephone 等絲氨酸蛋白酶?jìng)魉托盘?hào)，通過蛋白酶水解級(jí)聯(lián)使胞外因子Sp?tzle 活化，并使其結(jié)合Toll 跨膜受體，從而促進(jìn)Toll 受體胞內(nèi)域招募聚集3 種胞漿蛋白（Myd88、Tube 和Pelle），Pelle激酶促使抑制因子Cactus 發(fā)生磷酸化和蛋白水解然后釋放NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子Dorsal，Dorsal 從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，并結(jié)合抗菌肽基因的啟動(dòng)子元件，在Cactin、Pellino 和Traf 等調(diào)控作用下誘導(dǎo)抗菌肽 drosomycin、defensin、cecropin、attacin 的 表達(dá)［5，8，10，12，15］。多數(shù)病毒、革蘭氏陽性菌、真菌以及瘧原蟲均能夠激活Toll 信號(hào)通路［3，10］，而微生物不再入侵昆蟲時(shí)，Serpin 抑制劑則能夠發(fā)揮抑制作用，阻止Toll通路的持續(xù)激活［10，12，15］。

昆蟲Toll 蛋白具有介導(dǎo)先天性免疫、表達(dá)抗菌肽、調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)發(fā)生等多種功能［12，52］。果蠅中已完成9 個(gè)Toll基因（Toll1 至Toll9）的鑒定，本研究中小胸鱉甲檢測(cè)到67 個(gè)Toll基因的同源unigene，但未檢測(cè)到全部種類的Toll基因，且尚不清楚每個(gè)Toll 蛋白在小胸鱉甲中的作用。小胸鱉甲中具有編碼Dorsal 的基因同源unigene，但未發(fā)現(xiàn)Dif 的同源unigene，可能是Dif 屬于高度衍生的分支，僅在短尾蒼蠅（Brachyceran flies）中發(fā)現(xiàn)［19］。因此，Dorsal 是小胸鱉甲發(fā)生Toll 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)抗菌肽所需的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄因子。

2）IMD -JNK 通路及其調(diào)控。IMD 信號(hào)通路可有效抵御革蘭氏陰性菌的侵染［3，5，8，10，15］，但小胸鱉甲缺少IMD、kenny以及FADD這3 個(gè)IMD 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因。從圖3 可知，小胸鱉甲免疫系統(tǒng)中，G-菌體表附著的肽聚糖可以結(jié)合細(xì)胞跨膜受體PGRP，從而使PGRP 胞內(nèi)域招募Dredd，完成胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在TAK1/TAB2 復(fù)合物的作用下IκB 激酶IRD5（IκBγ）磷酸化，促使NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子Relish 蛋白斷裂，其中Relish-N 經(jīng)核轉(zhuǎn)運(yùn)因子NTF2（nuclear transport factor 2）的輔助，轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與Akirin共同調(diào)控cecropin，attacin，diptericin和drosocin等抗菌肽基因的表達(dá)［5，8，10，14，15］。IMD 信號(hào)通路也分支到JNK 通路和細(xì)胞凋亡：蛋白酶Dredd 不僅可以介入裂解Relish，還可以招募、裂解pro-caspase，形成的caspase 同時(shí)能夠加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程；在hemipterous（MAPKK7）作用下，TAK1/TAB2 復(fù)合物還能夠完成JNK 磷酸化，從而激活JNK 通路［5，8，10，14，15］。

相較小胸鱉甲缺失組分的IMD 通路，在果蠅、家蠶、伊蚊以及赤擬谷盜等昆蟲中均已找到IMD 通路基因的直向同源物［5，8，10，14，15，32］。然而蜱螨（Tetranychus、Metaseiulus以及Ixodes）、木蟻（Camponotus floridanus）、豌豆蚜還有麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）則類似于小胸鱉甲，缺失IMD 信號(hào)通路上的關(guān)鍵基因［15］。有研究表明，IMD 通路中的基因被敲除后會(huì)使果蠅對(duì)某些G+菌和真菌更加敏感從而導(dǎo)致死亡［53］，揭示IMD 通路介導(dǎo)的組織損傷反應(yīng)是防御微生物的重要過程。而小胸鱉甲IMD 通路核心組分的缺失現(xiàn)象，是否反映了小胸鱉甲抵御病原體的免疫潛力較低，或者是否存在未知因子參與構(gòu)建IMD 通路，還有待深入研究。

在小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中注釋到9 個(gè)Sickie、115 個(gè)CYLD 以及25 個(gè)Cullin 同源unigene，它們表達(dá)的蛋白是IMD 通路的負(fù)調(diào)控因子。Sickie 對(duì)Dredd 誘導(dǎo)的Relish 活化具有相反的作用；去泛素化酶CYLD調(diào)節(jié)IKK 復(fù)合物以控制Relish 磷酸化，可抑制IMD信號(hào)傳導(dǎo)；Cullin 蛋白參與調(diào)控Relish-N 的磷酸化［5，8，14，15］。IMD 通路釋放過量的抗菌肽，對(duì)宿主本身并無益處。所以，精準(zhǔn)的負(fù)調(diào)控機(jī)制才能保證IMD 途徑可以在合理范圍內(nèi)反應(yīng)。

3）MAPK-JNK-p38 通路及其調(diào)控。從實(shí)質(zhì)上來看，JNK 信號(hào)是有絲分裂激活的蛋白激酶MAPK通路，參與調(diào)節(jié)昆蟲的發(fā)育和代謝、免疫反應(yīng)等［15-17］。小胸鱉甲具有JNK 通路的核心免疫相關(guān)基因Hep、JNK（basket）、Jra 和Fos［15］，該通路以保守的狀態(tài)進(jìn)化。

JNK 信號(hào)通路由一系列胞外因子和胞內(nèi)的應(yīng)激物誘導(dǎo)激活，可通過多條分支接收傳導(dǎo)信號(hào)：①JNK可 由IMD通路的TAK1 激酶（即MAPKKK7）激活［5，14，15］；②可由混合連接激酶MLK1（MAPKKK 激酶）激活［5，15］；③由MKK4（MAPKK 激酶）激活［5，15］；④由血小板衍生和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（PVF）及其受體PVR（Ser/Thr 激酶）介導(dǎo)激活［5］；⑤由腫瘤壞死因子同源物Eiger（egr/TNF）、受體Wengen（wgn/TNFR）、TRAF（TNF receptor associated factor）和Misshapen 途徑依次激活TAK1、hemipterous（MKK7）和JNK［5，17］；⑥通過Toll 受體與TRAF 激活p38 激酶，級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)Jra-Fos 復(fù)合物的形成（JNK 通路下游基因［5，17］）。

JNK 收到多條上游分支傳導(dǎo)的激活信號(hào)后，會(huì)誘導(dǎo)Jra-Fos 復(fù)合物即轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1（Activator protein 1）的形成。該轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合多種基因啟動(dòng)子區(qū)的AP-1 位點(diǎn)，促進(jìn)特定基因的轉(zhuǎn)錄，從而表達(dá)靶蛋白參與到應(yīng)激、傷口愈合、凋亡、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞免疫反應(yīng)中［8，10，54］。

4）JAK-STAT 通路及其調(diào)控。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組注釋到編碼JAK-STAT 通路核心組分JAK 和STAT的基因同源unigene，然而，跨膜受體Domeless 以及激活果蠅JAK-STAT 通路的關(guān)鍵配體細(xì)胞因子Unpaired（Upd1、Upd2 和Upd3）還沒有檢測(cè)到［8，13］。JAK 激酶（Hopscotch）接收信號(hào)后，使轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化，磷酸化的STAT 以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)表達(dá)含硫酯蛋白（TEP）為代表的抗病毒蛋白等效應(yīng)物［42］。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組具有調(diào)控基因SOCS和PIAS的多條unigene，其編碼的SOCS（JAK抑制劑）和PIAS（活化STAT 的蛋白抑制劑）蛋白，可以調(diào)控JAK-STAT 信號(hào)通路，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)小胸鱉甲的免疫應(yīng)答及多種發(fā)育過程，包括抗病毒免疫反應(yīng)［3，10，13，18］。

昆蟲JAK-STAT 信號(hào)通路高度保守，但小胸鱉甲未注釋到Domeless 和Upd，考慮可能是遺漏或者存在其他未知的跨膜受體和配體，如煙草天蛾除了domeless 之外，還存在未知跨膜受體可以與Vago 的直系同源物結(jié)合，以類似于domeless 配體的方式激活JAK 和STAT［5］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，赤擬谷盜、意蜂和煙草天蛾等昆蟲也缺失Upd 配體［5，19，27］。

5）RNAi 途徑。參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的RNAi 包括piRNA、miRNA 和siRNA，RNAi 利用siRNA 的反義鏈切割靶mRNA 引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在昆蟲防御病毒感染機(jī)制中發(fā)揮重要作用［10，18，55］。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中具有編碼siRNA 通路核心組分Dicer-2 和Argonaute-2 的基因同源unigene，以及編碼miRNA和piRNA 的核心組分Argonaute-1 和Argonaute-3 的基因同源unigene，這些小RNA 可參與構(gòu)成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，在小胸鱉甲抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮作用［56］。

6）自噬和凋亡過程。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡過程在昆蟲機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和新陳代謝、組織損傷反應(yīng)和抗病毒感染機(jī)制等許多方面具有重要意義［57，58］。小胸鱉甲中自噬相關(guān)蛋白Atg，可以調(diào)控自噬過程。昆蟲在自噬發(fā)生過程中受到磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲/蘇氨酸激酶（Akt）通路調(diào)控，該途徑中PI3K 能夠磷酸化底物并激活下游的Akt，Akt 進(jìn)一步磷酸化雷帕霉素靶蛋白（TOR），TOR 通過磷酸化使形成的自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物Atg13-ULK1 失活，影響自噬小體的生物發(fā)生，進(jìn)而抑制自噬［57］。在小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中注釋到DNA 損傷自噬調(diào)整蛋白（DRAM），其參與自噬體與各種囊泡的融合過程，能夠促進(jìn)自噬體的積累并且調(diào)控自噬溶酶體的形成［57］。一些病原體可以靶向自噬體，然后被溶酶體降解［57］。在果蠅中，自噬被一些病毒、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌（例如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌）和其他病原體感染誘導(dǎo)［18，59］，表明自噬也可能是一種經(jīng)典的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

入侵昆蟲細(xì)胞的病毒，可通過觸發(fā)細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，激活一系列半胱氨酸蛋白酶caspase 引發(fā)一種主動(dòng)的細(xì)胞凋亡，用以抑制入侵的病毒的擴(kuò)散和復(fù)制［58］。小胸鱉甲具有凋亡途徑的組分caspase Dronc、IAP、Sickle（與Reaper 顯著相似）和Hid，可分別從內(nèi)部和外部觸發(fā)細(xì)胞凋亡，在應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御機(jī)制中發(fā)揮作用［58］。在昆蟲細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)受到啟動(dòng)因子caspase Dronc 和caspase 的負(fù)調(diào)節(jié)因子（IAP）的共同調(diào)控，同時(shí)，促凋亡蛋白Sickle，即IAP 拮抗劑，也能通過使IAP 失活參與調(diào)控凋亡過程［60］。而在細(xì)胞外部引發(fā)的凋亡信號(hào)是通過JNK 通路來傳導(dǎo)的。IMD 通路、toll 通路以及細(xì)胞膜錨定外部蛋白Eiger 都可以通過激活JNK 信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Eiger 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也受到IAP 抑制［58］。雖然凋亡通常涉及病毒致病，但某些病毒已學(xué)會(huì)利用該機(jī)制，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中獲得了各種抗凋亡的基因，以不同的方式促進(jìn)自身的生存和復(fù)制［61］。

3.3 免疫效應(yīng)因子

1）抗菌肽。昆蟲的免疫防御體系主要由多種抗菌肽發(fā)揮作用，已知的昆蟲抗菌肽就有170 余種。在小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索昆蟲抗菌肽的基因，檢測(cè)到7 個(gè)drosomycin、4 個(gè)defensin、5 個(gè)attacin、3 個(gè)tenecin、2 個(gè)holotricin、1 個(gè)cecropin以及1 個(gè)anionic antimicrobial peptide基因同源unigene。由于物種特異性抗菌肽的存在，且這些分子的序列具備多樣性特點(diǎn)，基于同源性的搜索可能遺漏了一些抗菌肽基因。防御素（Defensin）可抵御革蘭氏陽性菌，攻擊素（Attacin）與天蠶素（Cecropin）可抑制革蘭氏陰性菌，而抗真菌肽（Drosomycin）具有較高的抗真菌活性［4，8，10，62］，這些抗菌肽是組成小胸鱉甲免疫防御體系的重要成員。

2）溶菌酶與幾丁質(zhì)酶。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組注釋到c 型、i 型以及p 型lysozyme基因的同源unigene。Lysozyme 蛋白能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖和胞壁酸［63］，是抵抗細(xì)菌感染的關(guān)鍵因素。在小胸鱉甲的幾丁質(zhì)酶中，編碼酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶（Acidic mammalian chitinase）基因的同源unigene 比較多，這類Chitinase 蛋白具有降解幾丁質(zhì)活性，可參與對(duì)抗線蟲、真菌和其他病原體的防御，在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用［64］。

3）熱休克蛋白與肌動(dòng)蛋白。小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中具有多種不同分子量的Hsp和actin基因的同源unigene（表4）。已知HSP 是應(yīng)激蛋白，因此病原體的侵染也能誘導(dǎo)HSP 的合成，在許多昆蟲中，已顯示HSP 在感染性損傷和微生物入侵后被上調(diào)表達(dá)［65］。在免疫反應(yīng)中，HSP 也可作為重要的信號(hào)蛋白［65］。家蠶組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抗性添毒個(gè)體中actin 和HSP 呈現(xiàn)高表達(dá)，由于actin 的過表達(dá)能夠干擾病毒多角體合成和組裝［66］，因此推測(cè)actin 和HSP 都參與家蠶抗病毒過程。小胸鱉甲表達(dá)的actin 和HSP 蛋白是否有助于抵御病毒也值得進(jìn)一步研究。

4）其他免疫反應(yīng)效應(yīng)蛋白。小胸鱉甲注釋到酚氧化酶（PO）、酚氧化酶原（proPO）、芳基貯存蛋白（Arylphorin）和六聚體儲(chǔ)存蛋白（Hexamerin）的基因同源unigene，這些基因編碼的蛋白都可參與細(xì)胞吞噬、集結(jié)、包囊和黑化作用，在昆蟲的先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［67，68］。已有研究發(fā)現(xiàn)PO 和多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase，Ddc）參與果蠅血細(xì)胞的集結(jié)［6，68］。PO 與hexamerin、arylphorin 都屬于節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白hemocyanin 超家族，在昆蟲免疫防御中，有些血藍(lán)蛋白表現(xiàn)出酚氧化酶催化活性，甚至可以轉(zhuǎn)化為酚氧化酶，hemocyanin 和hexamerin 均已證實(shí)與節(jié)肢動(dòng)物的免疫功能相關(guān)［69］。集結(jié)、包囊以及黑化作用可將小胸鱉甲免疫反應(yīng)定位到損傷部位以迅速清除病原物和受損細(xì)胞［2，6，68］。

細(xì)胞免疫反應(yīng)過程中，局部產(chǎn)生自由基也是非常重要的免疫反應(yīng)，對(duì)防御病原微生物十分有效［2，6，8］。自由基以及自由氧簇（包括O2-、ROS、OH-、H2O2和RNS）均可協(xié)助血細(xì)胞吞噬病原體，并在包囊作用中殺死病原體［2，6，8］。由于ROS 和RNS的細(xì)胞毒性，它們的轉(zhuǎn)化率和濃度受機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，從而防止昆蟲受到過剩自由基攻擊造成損傷［2，6，8］。小胸鱉甲注釋到的抗氧化酶包括：過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、硫醇抗氧化酶（thiol peroxiredoxin，TP）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、硫氧還蛋白（thioredoxin）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）以 及NADPH 氧 化 酶（NADPH oxidase）。在小胸鱉甲氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫防御反應(yīng)中，上述成分可發(fā)揮重要的作用［2，6，8］。有報(bào)道稱，基因突變或基因敲除引起的自由基水平的變化，對(duì)按蚊的繁殖力及其抗瘧疾反應(yīng)均有較大影響［70］。

綜上所述，小胸鱉甲轉(zhuǎn)錄組中有1 750 個(gè)免疫相關(guān)基因的同源unigene，共107 個(gè)編碼免疫相關(guān)蛋白的基因，表達(dá)的蛋白可以參與到toll、IMD、MAPKJNK-p38、JAK-STAT 免疫信號(hào)通路中，以及RNAi、自噬、凋亡以及吞噬、包囊和黑化反應(yīng)。本研究構(gòu)建的小胸鱉甲免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，一些免疫通路（IMD 通路和JAK-STAT 通路）和一些組分（如IMD、FADD 和domeless 等）與模式生物之間存在差異。下一步還需要使用生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的免疫信號(hào)通路。本研究對(duì)荒漠昆蟲小胸鱉甲免疫相關(guān)基因的注釋和分析，既充實(shí)了昆蟲免疫相關(guān)基因的研究?jī)?nèi)容，也加深了對(duì)昆蟲天然免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)。