Card9與腸道疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展

紀(jì)昌學(xué) 楊志文

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院血管介入科，上海 201600；2上海市松江區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201600

胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase recruitment domain containing protein 9，Card9）是機(jī)體的一種重要免疫炎性蛋白，主要分布于抗原提呈細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。Card9活化后，激活下游核因子（NF）-κB、MAPK信號通路，釋 放 大 量 白 細(xì) 胞 介 素（IL）-6、IL-1β、腫 瘤 壞 死 因 子（TNF）-α等炎癥因子，在感染性疾病，尤其真菌感染中起著重要的免疫保護(hù)作用。目前，已有大量文獻(xiàn)報道Card9在炎性腸病、結(jié)腸炎癌變、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［1］。因此，本文擬對Card9在炎性腸病、結(jié)腸炎癌變、結(jié)腸癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，為Card9靶向治療的腸道疾病提供理論依據(jù)。

Card9在腸道中的表達(dá)情況及其作用

先天免疫細(xì)胞通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）特異識別病原微生物，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，從而清除和消滅入侵細(xì)菌、真菌、病毒等致病菌。已知，PRR主要有4類，C型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLR）、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）、RIG-I樣受體（RIG-I like receptors，RLR）和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide binding oligomerzation domain，NOD）。已證實，Card9作為關(guān)鍵的傳感器，參與CLR、TLR、NOD介導(dǎo)信號通路：細(xì)胞膜表面受體CLR激活后，活化定位在細(xì)胞質(zhì)中的Card9，從而激活炎癥介質(zhì)NF-κB，存在CLR-Card9-NFκB信號通路參與宿主真菌感染的反應(yīng)［2］；細(xì)胞膜表面受體TLR激活后，活化定位在細(xì)胞質(zhì)中的Card9，從而激活炎癥介質(zhì)p38，存在TLR-Card9-p38信號通路參與宿主細(xì)菌感染的反應(yīng)［3］；細(xì)胞內(nèi)受體NOD激活后，活化定位在細(xì)胞質(zhì)中的Card9，從而激活炎癥介質(zhì)p38，存在NOD-Card9-p38信號通路參與宿主細(xì)菌感染的反應(yīng)［3］。

腸道微生態(tài)系統(tǒng)由腸道正常菌群及其所生活的環(huán)境共同構(gòu)成，腸道微生物量占人體總微生物量的78%，腸道菌種類超過1 000種，其組成成分極為復(fù)雜，包括多種細(xì)菌、真菌、古細(xì)胞甚至一些病毒，腸道微生態(tài)平衡對人類抵抗腸道病原菌引起的感染性疾病非常重要。Card9能夠識別腸道微生物，從而參與維持腸道微生態(tài)平衡［4-5］。Malik等［4］報道了Card9基因敲除小鼠腸道真菌種類變化，與野生型小鼠相比，Card9基因敲除小鼠腸道酵母菌的數(shù)量增加，而子囊菌的數(shù)量減少；Lamas等［5］報道了Card9基因敲除小鼠真菌特征變化，在第7天腸道真菌負(fù)荷達(dá)到高峰，且接合菌、擔(dān)子菌、子囊菌等真菌作為腸道真菌群的主要組成部分。Malik等［4］發(fā)現(xiàn)了Card9基因敲除小鼠腸道的支原體、類桿菌、厭氧菌和里研菌等細(xì)菌的數(shù)量明顯增加，而α-變形菌、螺桿菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌、帕拉普氏菌和大腸桿菌等細(xì)菌的數(shù)量明顯減少。Lamas等［5］在Card9基因敲除小鼠的糞便中進(jìn)一步證實了瘤胃球菌的數(shù)量明顯減少。此外，Card9基因敲除小鼠腸道的色氨酸代謝所需微生物群數(shù)量明顯減少，如阿洛巴氏菌和羅特乳酸桿菌。由于色氨酸代謝所需微生物缺失，導(dǎo)致腸道色氨酸代謝的芳基烴受體易感性降低，最終抑制Card9基因敲除小鼠的色氨酸代謝，引起腸道功能紊亂［5］。

Card9存在于人體多種組織中，在脾、肝、胎盤、肺、淋巴組織、腦等組織中均有不同程度的表達(dá)。Yang等［6］收集10例結(jié)腸癌患者的組織標(biāo)本，明確Card9在腸道組織細(xì)胞中的分布。結(jié)腸組織免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)腸癌旁組織中Card9蛋白低表達(dá)，但在結(jié)腸癌組織中Card9表達(dá)水平顯著增加；Card9靶向分布于腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞，而在結(jié)腸癌細(xì)胞中不表達(dá)［6］。此外，Card9免疫組化表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞密度呈正相關(guān)［6］：Card9在人結(jié)腸低分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞、人結(jié)腸中分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞、人結(jié)腸高分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的陽性率分別為（13.17±1.35）%、（4.04±0.52）%、（1.99±0.41）%，提示Card9在人結(jié)腸低分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中表達(dá)最高；CD68（巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）標(biāo)記的巨噬細(xì)胞在人結(jié)腸低分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞、人結(jié)腸中分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞、人結(jié)腸高分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的陽性率大約為14%、5%、2%，顯示巨噬細(xì)胞在人結(jié)腸低分化轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞密度最高［6］。

Card9在炎性腸病中的作用

Card9主要包含2個功能區(qū)，一個位于N末端區(qū)，有7～98個氨基酸殘基，具有凋亡等功能；另一個位于C末端區(qū)，有140～420個氨基酸殘基，主要行使蛋白質(zhì)寡聚化功能。已知，Card9的C端、N端、啟動子區(qū)域存在20多個與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點，如R18W、R70W、R101C、Q289、Q295、rs10870077、rs4077515、rs10781499等［7］。已證實某些特定Card9單核苷酸多態(tài)性位點影響炎性腸病的臨床轉(zhuǎn)歸［7］，其作用機(jī)理歸因于Card9單核苷酸多態(tài)性影響Card9表達(dá)水平或功能，導(dǎo)致炎癥因子分泌上調(diào)或下調(diào)。

2008年Zhernakova等［8］對1 815例炎性腸病患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Card9 rs10870077單核苷酸多態(tài)性（胞嘧啶C被鳥嘌呤G替代）為炎性腸病患者Ⅲ期的易感因素，可能通過影 響 了腸 道 微 生 物 的 免 疫應(yīng) 答 。2012年Lee和Song［9］對968例炎性腸病患者進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，Card9非編碼區(qū)rs4077515（胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代）單核苷酸多態(tài)性為炎性腸病患者的危險因素，可能通過改變了腸道炎癥微環(huán)境。2018年Imhann等［10］對313例炎性腸病患者進(jìn)行分析，Card9 rs10781499（腺嘌呤A被鳥嘌呤G替代）被認(rèn)為是炎性腸病的遺傳高風(fēng)險因素，Card9 rs10781499可影響腸道上皮細(xì)胞完整性、輔助T17細(xì)胞功能、腸道微生態(tài)。2012年Rivas等［11］對313例 炎 性 腸 病 患 者 進(jìn) 行 分 析 ，Card9 rs141992399 G＞C是炎性腸病的保護(hù)性因素。同樣，Card9 rs200735402 C＞T也顯示了對炎性腸病的保護(hù)作用。這可能歸因于Card9單核苷酸多態(tài)性影響Card9基因特定的外顯子缺失，導(dǎo)致Card9某些轉(zhuǎn)錄和翻譯受到限制，最終Card9蛋白生物活性的丟失，抑制腸道炎性反應(yīng)［11］。綜上，Card9 rs10870077 C＞G、Card9 rs4077515 C＞T、Card9 rs10781499 A＞G是炎性腸病患者的危險因素，而Card9 rs141992399 G＞C、Card9 rs200735402 C＞T是炎性腸病的保護(hù)因素。

值得注意的是，2015年Wang等［12］對288例中國人群炎性腸病患者進(jìn)行分析，Card9 rs10870077 C＞G、Card9 rs10781499 A＞G與炎性腸病沒有任何關(guān)聯(lián)性，作者把這不一致的結(jié)果歸因于東西方人類種族的差異。

此外，Cao等［13］報道一種新型的Card9激活機(jī)制參與腸道炎性反應(yīng)：Card9的C端與TRIM62蛋白結(jié)合，形成Card9/TRIM62蛋白復(fù)合體，招募多泛素化蛋白K27，誘導(dǎo)Card9泛素化，釋放大量炎癥因子，而TRIM62基因敲除小鼠顯著降低炎癥因子分泌，減輕腸道炎性反應(yīng)。小分子化合物BRD5529選擇性地與Card9結(jié)合，破壞TRIM62募集，抑制TRIM62介導(dǎo)的Card9泛素化和激活［14］。

Card9在結(jié)腸炎癌變中的作用

結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌（colitis-associated cancer，CAC）通常由炎性腸病發(fā)展而來，是炎性腸病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，其癌變模式就是通過炎癥-癌變途徑發(fā)生的。研究表明，腸道菌群紊亂在CAC的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，其主要通過腸黏膜誘導(dǎo)異常免疫應(yīng)答引發(fā)疾?。?5］。

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）小鼠模型是致癌劑AOM和致炎劑DSS兩者協(xié)同作用基礎(chǔ)上，產(chǎn)生腸黏膜炎癥損傷，由炎性腸病逐步發(fā)展為癌癥，因為AOM/DSS小鼠模型能較好地模擬腸道炎癌變的生理病理過程，已廣泛應(yīng)用于CAC的研究［15］。

Wang等［16］發(fā) 現(xiàn) 在AOM/DSS誘 導(dǎo) 的 小 鼠 模 型 中 ，Card9基因敲除后，CAC瘤體大小和數(shù)量顯著增加，提示Card9高表達(dá)能夠抑制CAC的發(fā)生發(fā)展。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Card9基因敲除小鼠抗真菌能力顯著下降，導(dǎo)致腸道真菌種類和數(shù)量發(fā)生明顯增加，而白色念珠菌成為數(shù)量最多的真菌。有證據(jù)表明，在Card9基因敲除小鼠中，由于白色念珠菌增加，從而誘導(dǎo)CAC的發(fā)生發(fā)展［16］。與此同時，抗真菌藥物氟康唑可顯著降低Card9基因敲除小鼠的白色念珠菌數(shù)量，有效降低瘤體大小和數(shù)量，改善CAC的預(yù)后。Card9參與CAC潛在的分子機(jī)制可能是，Card9基因敲除后，小鼠腸道巨噬細(xì)胞的殺菌能力受損，導(dǎo)致白色念珠菌在腸道成為優(yōu)勢菌群，誘導(dǎo)髓系來源抑制細(xì)胞（MDSCs）在腸道組織中的聚集，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和清除能力，最終促進(jìn)CAC的發(fā)展［16］。Malik等［4］報道了相同的結(jié)果，Card9能夠減少腸道真菌數(shù)量，抑制CAC的發(fā)生發(fā)展。已知，炎癥小體是多聚體蛋白復(fù)合物，可激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1，參與IL-18的蛋白水解過程［17］，而IL-18可保持腸道上皮細(xì)胞屏障完整性，并刺激腸CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ［18］。Card9基 因 敲 除 的CAC小 鼠 中 ，炎 性 小 體 和IL-18顯著降低［16］。Card9基因敲除小鼠給予Casp1+/+骨髓來源的髓樣細(xì)胞以及外源性IL-18，可顯著增加T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ，產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果［16］。

然而，Bergmann等［19］報道Card9促進(jìn)CAC的發(fā)生發(fā)展。與野生型小鼠相比，Card9基因敲除小鼠瘤體大小和重量明顯降低。已知，Card9可誘導(dǎo)IL-1β分泌，從而激活I(lǐng)L-22介導(dǎo)的STAT3腫瘤信號通路［20］。Card9基因敲除的CAC小鼠中，下調(diào)IL-1β分泌，抑制腸道淋巴細(xì)胞IL-22表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞STAT3信號通路，最終產(chǎn)生抗腫瘤效果［19］。

Card9在結(jié)腸癌的中的作用

2014年Yang等［6］對48例 結(jié) 腸 癌 患 者 研 究 發(fā) 現(xiàn) ，Card9表達(dá)水平與臨床病理組織特征具有顯著的相關(guān)性：Card9表達(dá)水平與結(jié)腸癌分化程度負(fù)相關(guān)，低分化結(jié)腸腫瘤（12例）、中分化結(jié)腸腫瘤（29例）、高分化結(jié)腸腫瘤（7例）中的免疫組化Card9陽性率分別為（16.01±1.54）%、（6.44±0.52）%、（1.04±0.28）%（P＜0.05）；Card9表達(dá)水平與結(jié)腸癌浸潤程度和轉(zhuǎn)移、結(jié)節(jié)、復(fù)發(fā)率正相關(guān)，如T1（2例）、T2（6例）、T3（31例）、T4（9例）結(jié)腸浸潤的Card9陽性率分別為（1.52±0.80）%、（3.35±1.40）%、（8.98±0.95）%、（12.41±2.94）%（P＜0.05），M0（45例）和M1（3例）遠(yuǎn)端 轉(zhuǎn) 移的Card9陽 性 率 分 別 為（7.34±0.75）%、（23.05±3.60）%（P＜0.05）［6］。結(jié)腸癌患者腫瘤組織中的Card9 mRNA和蛋白水平遠(yuǎn)高于癌旁組織，其中Card9 mRNA水平大約高出4倍。巨噬細(xì)胞在正常組織中浸潤數(shù)量較少，而在腫瘤組織中浸潤數(shù)量明顯增加，且M2極化標(biāo)志物CD163也明顯增加，提示腫瘤組織中浸潤巨噬細(xì)胞M2極化，可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展發(fā)展［6］。此外，Card9異常表達(dá)的結(jié)腸癌患者極易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，主要機(jī)制如下：促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞遷移；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-6，IL-12，IL-10，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等腫瘤促進(jìn)因子；激活NF-кB，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化［6］。

腸病相關(guān)T細(xì)胞淋巴瘤是一種罕見的人小腸原發(fā)性T細(xì)胞淋巴瘤［21］。Tomita等［21］收集20例來自日本的腸病相關(guān)T細(xì)胞淋巴瘤患者，采用寡核苷酸芯片和熒光原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)這20例患者中15例的Card9異常表達(dá)（高達(dá)75%），提示Card9可能是腸病相關(guān)T細(xì)胞淋巴瘤的易感基因。Deleeuw等［22］也報道了類似的研究，Card9與腸病相關(guān)T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)，且未發(fā)現(xiàn)東西方人群中的種族差異。

展 望

Card9主要分布于巨噬細(xì)胞的胞漿中，能夠激活NF-κB、MAPK炎癥信號通路，釋放和分泌炎癥因子，在微生物感染中起著至關(guān)重要的作用。腸道微生態(tài)系統(tǒng)由腸道正常菌群及其所生活的環(huán)境共同構(gòu)成，包括大量的細(xì)菌、真菌和病毒，這些微生物可特異性結(jié)合腸道巨噬細(xì)胞PRR，從而激活下游信號分子Card9，存在Card9參與炎性腸病、結(jié)腸炎癌變、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

腸道微生物群較為復(fù)雜，且受多種因素影響，Card9在腸道疾病中的作用尚不完全清楚。本文在對Card9與腸道疾病相關(guān)性的綜合分析，也發(fā)現(xiàn)不同學(xué)者觀點也不一致：有研究顯示Card9單核苷酸多態(tài)性是炎性腸病患者的危險因素，但另外一些研究發(fā)現(xiàn)Card9單核苷酸多態(tài)性是炎性腸病的保護(hù)因素；有研究表明Card9促進(jìn)結(jié)腸炎癌變的發(fā)生發(fā)展，但另外一些研究發(fā)現(xiàn)Card9抑制結(jié)腸炎癌變的發(fā)生發(fā)展；臨床研究顯示Card9促進(jìn)腫瘤作用，但在一些動物實驗中顯示Card9有抑制腫瘤作用。因此，需要學(xué)者進(jìn)一步研究探索Card9在腸道疾病中的作用及其分子機(jī)制，明確Card9如何調(diào)控腸道微生物，闡明Card9在腸道疾病診治方面的價值。