拉曼光譜技術在病原微生物檢測中的應用

劉風翔，何 帥，張禮豪，黃 霞，宋一之

中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所醫(yī)用檢驗技術研究室，江蘇 蘇州 215163

引 言

微生物在自然界中廣泛存在，具有個體小、分布廣、種類多、生長繁殖速度快等特點，在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領域扮演著重要角色。隨著基因組學、結構生物學、聚合酶鏈式反應(PCR)技術以及顯微技術等學科與技術日益成熟，微生物的研究價值越發(fā)凸顯。在幾萬種微生物中，只有一少部分微生物會造成人和動物感染繼而引發(fā)疾病，這部分微生物被稱為病原微生物，由病原微生物感染而引發(fā)的疾病在臨床醫(yī)學領域極為常見[1]。由于其種類具有多樣性，加之不時出現(xiàn)新的病原體，給臨床診斷帶來了巨大困難[2]?？股厥侵委煾腥拘约膊〉闹匾幬铮陌l(fā)現(xiàn)有效控制了病原微生物的感染，挽救了數(shù)以億計的生命[3]。與此同時，抗生素的長期使用和濫用會使病原菌的藥物敏感性降低，甚至消失。微生物檢驗是對感染性疾病進行臨床診斷的重要依據(jù)，傳統(tǒng)的臨床病原菌診斷主要依賴于細菌培養(yǎng)。這種檢驗方法耗時較長，在無法快速鑒別致病菌及檢測其藥物敏感性的情況下使用抗生素，加速了病原菌耐藥性的產(chǎn)生，甚至導致耐藥菌株不斷蔓延傳播。有研究指出：2000年至2015年期間，各國平均抗生素消費率從每天每1千名居民16.4次已增長至20.9次[4]。由于抗生素的濫用，導致了對多種抗生素耐藥的“超級細菌”產(chǎn)生，并且已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。世界衛(wèi)生組織在2016年引用Mullard[5]的報告指出，因耐藥細菌感染導致死亡人數(shù)約每年70萬例，至2050年，每年將有超過100萬人死于耐藥菌感染。盡管圍繞病原微生物檢測的技術已有大量的研究報道，但目前已有的檢測方法尚不能實現(xiàn)對其進行快速準確的檢測。因此，病原微生物的高靈敏度無損檢測與鑒定一直都是微生物相關行業(yè)的主要研究方向。

拉曼光譜技術是一種對樣品進行原位、非侵入性、無標記的檢測技術，可快速、無損地對單個細胞進行表征及鑒定。通過對特定光譜信息進行識別，可以高特異性的對細胞內(nèi)分子變化進行監(jiān)測，同時由于水幾乎沒有拉曼峰，對檢測結果干擾性極小，因此該技術非常適合用于生物醫(yī)學領域的研究[6]。拉曼光譜在單細胞水平上提供了微生物細胞中不同生物分子的指紋圖譜信息，通過這些信息可以確定微生物的種類、生理特征和突變表型等。此外，拉曼光譜技術對樣本的狀態(tài)沒有限制，固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)樣本均可以進行精準檢測，且可以對微量樣本進行檢測，可用于鑒別生物組織微小變化。

本文對病原微生物檢測技術及現(xiàn)狀進行調(diào)研分析，簡單概述了拉曼光譜技術的原理，并在文章第四部分進一步對拉曼光譜技術在病原微生物檢測中的研究進展展開討論，就其在微生物檢測領域的發(fā)展前景進行了展望。

1 病原微生物檢測的意義及現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的臨床微生物檢測方法通常需要數(shù)個小時，極大降低了臨床病原微生物的快速檢測和鑒定的有效性與實用性。由于廣譜抗菌藥物的濫用，病原微生物的耐藥率逐年遞增[7]。

在實際的臨床檢驗中，病原微生物的分離、鑒定均需要培養(yǎng)，而培養(yǎng)時間往往需要數(shù)天，甚至數(shù)周。并且有些病原微生物的培養(yǎng)條件極其苛刻，甚至無法被培養(yǎng)[2]。所以，微生物快速精準檢測是臨床醫(yī)學重要研究方向。

目前，主要的病原微生物檢測方法包括分子遺傳學、表型鑒定法和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測法(MALDI-TOF)等。分子遺傳學鑒定法可以達到核酸層面的鑒定，它主要針對的是質(zhì)粒DNA或病原菌染色體的檢測，包括堿基含量測定、基因芯片、聚合酶鏈式反應、核酸分子雜交以及全基因組測序等[8]。這些方法都有各自獨特的優(yōu)點，但存在檢測過程中不穩(wěn)定、檢測結果容易受外界條件干擾、檢測步驟繁瑣、檢測敏感程度低、檢測操作水平要求高和檢測時間過長等缺點[9]。表型鑒定法能夠達到細胞組分、蛋白質(zhì)、生理生化和形態(tài)這3個層面的鑒定，目前MALDI-TOF和全自動生化鑒定都被臨床大量應用。MALDI-TOF是一種軟電離質(zhì)譜技術，該技術采用軟件和參考數(shù)據(jù)庫相結合的方法對病原微生物進行檢測[10]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測技術一般依靠細菌的參考圖譜對細菌的種類進行鑒定，但是存在少部分遺傳背景相似的菌株較難判斷的情況。全自動病原微生物生化鑒定系統(tǒng)需要將細菌過夜培養(yǎng)形成菌落才能夠滿足檢測分析的基本條件，且數(shù)據(jù)庫中的病原菌種類有限進而導致了該系統(tǒng)應用上的局限性[11]。全自動藥敏分析也是基于表型的病原菌診斷方法，與手工藥敏相比縮短了檢測時間并提高了檢測通量，但病原菌培養(yǎng)和增殖步驟的檢測流程仍然緩慢。因此，研發(fā)新的病原微生物快速檢測和鑒定技術具有重要意義。

2 拉曼光譜技術原理

為了對微生物進行更加深入的探究，國內(nèi)外科學家研究了許多光譜技術，其中最具代表的為拉曼光譜檢測技術[12]。拉曼光譜的概念由印度物理學家Raman在1928年首次提出，隨著激光技術的迅速發(fā)展，拉曼光譜技術也隨之得到了廣泛應用。當光照射到物質(zhì)表面時會發(fā)生散射現(xiàn)象，有部分光波頻率發(fā)生了變化產(chǎn)生非彈性散射，這種非彈性散射光被稱為拉曼光譜。在散射過程中，入射光與物質(zhì)相互作用，物質(zhì)內(nèi)部分子與光子發(fā)生了能量交換，改變了出射光的能量，即光子的頻率發(fā)生了改變，此頻率變化的差值稱為拉曼位移[13]。拉曼位移僅取決于散射分子的內(nèi)部結構，可為分子定性分析提供依據(jù)[14]。生物大分子(如糖類、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等)中不同化學鍵及官能團的振動頻率，對應著不同的拉曼位移，這就意味著拉曼光譜可以提供待測樣品分子成分和結構的指紋圖譜，可用于分析檢測生物組織生化成分以及探索生物分子結構。

拉曼光譜通過提供待測樣品中各成分分子的振動光譜信息，對樣品成分進行精確分析，以此鑒別不同的細胞組織。近年來，圍繞拉曼光譜技術衍生發(fā)展出許多亞技術，如表面增強拉曼光譜(SERS)、傅里葉變換拉曼光譜(FT-Raman)、激光共振拉曼光譜(RRS)、共聚焦顯微拉曼光譜等相關技術。傅里葉變換拉曼光譜技術[15](FT-Raman)是在傳統(tǒng)技術的基礎上，對收集到的拉曼信號進行了傅里葉變換處理，此技術對樣品本身熒光干擾進行了改善，并且具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)勢。表面增強拉曼光譜技術[16](SERS)主要針對于拉曼信號較弱的不足進行了改進，將待測物分子吸附在金、銀等貴重金屬膠粒或粗糙的納米金屬表面，使待測物的拉曼信號增強了106～1015倍，大大提高了檢測靈敏度。激光共振拉曼光譜技術(RRS)是當激發(fā)光波長與待測物分子電子躍遷波長相同時發(fā)生的，該分子的某幾個特征帶的拉曼信號強度比常規(guī)散射要高出約106倍，靈敏度得到了極大的提升，更加適用于生物大分子的檢測[17]。共聚焦顯微拉曼光譜技術[18](CRM)是將共焦光學顯微技術與拉曼光譜檢測技術結合起來的一種新技術，利用光學顯微物鏡將激光光束聚焦至待測樣品表面上一點，從而減小了外部環(huán)境對檢測結果的干擾，還可以通過調(diào)節(jié)激光聚焦深度的檢測模式，分析不同深度的物質(zhì)結構信息。這些技術憑借著其無破壞性、非接觸性、穩(wěn)定且可實時監(jiān)測的特點在生物醫(yī)學領域發(fā)展迅速。作為一種多功能的生物醫(yī)學分析工具，拉曼光譜技術在細胞的動態(tài)觀察、疾病的診斷及檢測、病原微生物的鑒定及藥物敏感性檢測等方面具有極大潛力。拉曼光譜技術能夠對少量微生物樣本進行快速、準確、無損的檢測，在病原微生物檢測、疾病診斷等領域得到了迅速發(fā)展。全細胞拉曼光譜指紋圖譜包括了細胞內(nèi)所有的生物信息，包括蛋白質(zhì)、脂類以及糖類等，可以通過對這些生物大分子的含量與結構進行測定分析，確定微生物種類、生理特征以及突變表型，最終完成對病原微生物的鑒定[19]。

3 拉曼光譜應用于病原微生物檢測的研究進展

拉曼光譜技術作為一種對物質(zhì)結構、化學組成以及生長代謝過程進行分析檢測的手段，被廣泛應用于微生物學的研究領域中。隨著以拉曼光譜檢測技術為核心的亞技術誕生，改善了以往拉曼光譜技術信號強度弱的不足，實現(xiàn)了對微生物高精度的快速檢測分析。

3.1 病原微生物的分類與鑒定

近年來，在細菌分類和鑒定的臨床醫(yī)學相關領域涌現(xiàn)了許多以細菌培養(yǎng)為基礎的快速檢測技術，如質(zhì)譜法、熒光法、PCR技術等，但這些方法均存在操作繁瑣、成本高、耗時長等問題。拉曼光譜蘊含著細胞中豐富的生化信息，如核酸、糖類、蛋白質(zhì)等，可作為“生化指紋”解釋細胞內(nèi)分子結構組成、代謝活性以及生理狀態(tài)。大量的研究表明拉曼光譜技術可直接對細菌感染的臨床樣品進行非接觸快速檢測，這也使其成為了病原微生物無損分析檢測領域的焦點。

陳雪萍[20]構建了無標記的基于AgNPs+的表面增強拉曼光譜技術(SERS)檢測方法，結合多變量統(tǒng)計分析對金黃色葡萄球菌進行種屬鑒定。并對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌與甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌的差異特征進行分析。得出結論：基于AgNPs+的SERS檢測方法可探測到單個細菌的信號；耐藥菌株與敏感菌株的拉曼光譜譜峰的位置、強度和相對強度比例均有差異。陶站華[21]等利用光鑷拉曼光譜技術研究吲哚對金黃色葡萄球菌細胞中葡萄球菌黃素合成的抑制作用。結果表明：光鑷拉曼光譜技術可作為分析葡萄球菌黃素含量的有效方法。針對耐藥白色念球菌的鑒別與對不同機理抗菌藥的快速分類研究，李皓[22]對SERS進行了改進，提出了動態(tài)表面增強拉曼光譜法(D-SERS)，即當納米溶膠與待測分子溶液混合時就開始進行光譜采集，完成濕態(tài)到干態(tài)的動態(tài)采集過程，實驗結果表明此檢測方法準確度較高，對臨床用藥具有很大意義。董金穎[23]在實驗中選用10株標準純菌株，利用共聚焦顯微拉曼光譜技術對其進行檢測分析，得出結論：拉曼光譜可以應用于同種病原菌水平上的鑒定。此外，還利用共聚焦顯微拉曼光譜技術對等比例混合培養(yǎng)的鮑曼不動桿菌與大腸埃希菌進行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)物與純標準菌株的拉曼光譜存在細微差別。邵琳[24]等對腸炎沙門氏菌的高效檢測方法進行研究，將其分別與三條適配體結合，選用表面增強拉曼光譜技術進行信號采集，結果可以看出光譜在735 cm-1處有峰形尖銳的明顯特征峰，此處特征峰歸屬為胞嘧啶與尿嘧啶的代謝產(chǎn)物。對5種細菌混合培養(yǎng)后進行拉曼光譜檢測，通過特征峰強度的對比能夠在混合樣品中準確檢測出目標細菌腸炎沙門氏菌。得出結論：這種檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性好，可用于腸炎沙門氏菌的高效檢測。單細胞拉曼光譜技術還可用于鑒定血液透析用水中的病原微生物，Montanari[25]等選用288份血液透析用水中分類出的146株酵母菌，采用單細胞拉曼技術結合經(jīng)典微生物檢測技術的方法對其進行鑒定分析，并與標準菌株的拉曼光譜進行了比較，成功鑒定出了待測樣本中的菌株。蘇永波[26]等使用便攜式拉曼儀器對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及變形桿菌分別進行了信號采集，得出結論：三種細菌特征峰位置及強度均有明顯差異，因此SERS可用于此三類細菌的鑒別。有研究表明，表面增強拉曼光譜技術可為鑒別大腸桿菌與志賀氏菌病原體研究與應用提供依據(jù)。呂璞等[27]曾選擇大腸桿菌與志賀氏菌作為研究樣本，對其進行檢測，在600～700 cm-1拉曼圖譜范圍內(nèi)兩種菌的光譜圖可見明顯差異，且重現(xiàn)性良好。Stockel[28]等人對26種不同的分枝桿菌進行檢測分類，每種待測樣本菌選用50～100個完整的細胞進行研究，通過單細胞拉曼技術檢測并根據(jù)拉曼信號特征峰差異進行分析，成功區(qū)分了26種樣本，且準確率高達94%?？梢娎庾V技術可為鑒定密切相關菌提供有效的鑒定方法。宋一之等[29]將單細胞拉曼光譜與機器學習模型結合，實現(xiàn)了免培養(yǎng)和免染色的細菌革蘭氏染色分類鑒定預測，準確率甚至可高達100%，并且可以在尿液和血液感染樣品中成功應用。

3.2 病原微生物藥物敏感性研究

病原菌藥敏試驗是對病原菌進行抗生素敏感度檢測，根據(jù)其對不同抗生素的藥敏檢測結果，有選擇性地指導患者用藥。目前，臨床診斷藥敏試驗需要檢測病原微生物抗生素最小抑制濃度，此過程往往需要2～5 d的時間進行培養(yǎng)及分析。拉曼光譜技術具有超強的分辨能力，可以快速、非破壞性的對病原菌代謝活性進行檢測。相較于傳統(tǒng)方法，該技術無需制備樣品、無需進行微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢，使其成為了最適用于微生物耐藥性檢測的重要方法。

Berry[30]等發(fā)現(xiàn)，具有代謝活性的細菌可以被重水標記，其單細胞拉曼光譜中出現(xiàn)碳-氘化學鍵的特征峰(C-D峰)，因此首次提出了重水標記結合拉曼光譜技術可以實現(xiàn)對細菌代謝活性的檢測。2017年，宋一之等[31]提出：耐藥菌的識別可以通過檢測重水和抗生素同時作用后細菌單細胞拉曼的C-D峰實現(xiàn)，這一方法不需要對細菌進行分離純化和增殖，因此可用于耐藥菌的原位識別。Tao等[32-33]采用該方法，對導致齲齒的口腔微生物樣本在抗菌藥物作用后進行耐藥性檢測，能夠無損且定量的對口腔藥物的藥效進行評價，并提出了細菌代謝活性最小活性抑制劑濃度這一藥敏評價的指標，但也發(fā)現(xiàn)氨芐西林等抗生素盡管抑制細菌生長，但不抑制細菌單細胞代謝活性。Yang[34-35]等將該技術用于評價尿液病原菌的藥敏，發(fā)現(xiàn)僅需檢測40倍最小抑菌濃度抗生素作用后細菌單細胞的C-D峰強度特征，就可以快速判斷病原菌對該抗生素的敏感性。Hong[36]等將氘標記與受激拉曼光譜技術結合，檢測與萬古霉素混合培養(yǎng)的腸球菌對含氘葡萄糖進研攝取后細胞內(nèi)的C-D鍵拉曼強度，判斷細胞代謝活性。宋一之團隊[29]發(fā)現(xiàn)將抗生素與重水在不同時間點加入菌液或標本，可以減小氨芐西林等抗生素對細菌生長和代謝活性抑制效果的差異，提高了該技術在藥敏檢測中的準確率，建立了快速拉曼藥敏(FSAST)檢測方法。通過采集3 000多個實驗組的拉曼光譜，該團隊證明FRAST方法可直接用于真實尿液和血液標本，其藥敏結果與金標準總體一致率大于88%，尿液和血液藥敏檢測的時間可以分別縮短至3和21 h。上述研究證明了重水標記拉曼光譜術具有普遍適用性，可推廣至所有微生物細胞及對細胞代謝水平產(chǎn)生影響的藥物的檢測。

非同位素標記拉曼光譜技術也被應用于微生物藥敏檢測。付世杰[37]通過體外拉曼光譜檢測與體內(nèi)成像動物檢測模型實現(xiàn)了細菌對抗生素敏感性的快速評價，研究采用表面增強拉曼光譜技術快速評價了不同濃度種類的抗生素對細菌活性的影響。此外，還發(fā)現(xiàn)了抗生素在低濃度的條件下不能抑制細菌生長，反而會導致細菌增多的現(xiàn)象，這對臨床藥物評價具有指導意義。Germond[38]等通過實驗篩選出11株對不同抗生素產(chǎn)生抗體的大腸桿菌作為研究對象，采用非標記的方法對其進行檢測，預測了大腸桿菌獲得性耐藥的拉曼光譜標識，通過實驗發(fā)現(xiàn)，耐藥基因的表達與拉曼特征峰強度具有明顯相關性(p<0.05)。Kelly[39]等發(fā)現(xiàn)細菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生的氣體在金銀納米粒子表面會解離為甲基硫，吸附在表面形成的金硫鍵或者是銀硫鍵都可以產(chǎn)生極強的拉曼信號。采用表面增強拉曼光譜技術檢測氣體產(chǎn)生量，可以間接的檢測出細菌活性。蘇藍[40]對兩種常見致病菌進行了光譜檢測與分析。采用SERS技術檢測發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)特征峰的位置與強度對其進行區(qū)分。此外，還將SERS技術應用于對致病菌以及其耐藥菌株的快速鑒別，為臨床病原菌快速檢測以及個體化用藥提供了理論依據(jù)。對于拉曼檢測技術的可靠性驗證，劉曉瑩[7]在其研究中利用抗生素誘導篩選了金黃色葡萄球菌的耐藥菌株，并且結合最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)、藥敏紙片、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、SERS技術以及激光共聚焦顯微拉曼技術對細菌進行了耐藥性鑒定以及方法學驗證。得出結論：SERS技術在檢測抗生素敏感菌與致病菌方面具有很高的有效性和可靠性，為SERS技術在臨床病原微生物耐藥性檢測領域的應用奠定了基礎。

以上研究均可表明：拉曼光譜技術作為一種快速、準確和靈敏的微生物表型表征方法，在病原微生物快速鑒定以及藥敏檢測領域具有廣闊的發(fā)展前景。近年來，隨著光譜技術的迅速發(fā)展，對拉曼檢測技術的研究逐漸步入成熟期，但將其廣泛應用于臨床檢測，仍存在一定的改進空間，隨著光譜技術的發(fā)展和更精確靈敏光學元件的開發(fā)，病原微生物的快速精準檢測也將指日可待。

4 總結與展望

拉曼光譜技術在生物領域得到廣泛應用，尤其是在病原微生物檢測方面優(yōu)點突出。拉曼光譜技術可直接對細菌感染的臨床樣品進行非接觸快速檢測。相較于傳統(tǒng)方法，拉曼光譜技術具有無需制備樣品、無需進行微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢，使其成為了適用于微生物耐藥性檢測的重要方法。拉曼光譜檢測方法將臨床標準藥敏所需的48 h縮短至2.5 h內(nèi)完成，為臨床快速診斷與精準用藥提供了依據(jù)。拉曼光譜檢測成功克服傳統(tǒng)檢測的缺點，所需的樣品量少、標本鑒定預處理簡單、檢測能力強、檢測時間短、檢測特異性強、對于被測物無損傷、分離和鑒定可以同時進行。首先，大量生物學信息的處理需要更加智能化的分析系統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫。目前大量光譜數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)模型的建立仍需依賴專業(yè)的生物信息團隊。近年來不同的光譜分析軟件和數(shù)據(jù)庫的紛紛涌現(xiàn)，這代表著智能化、便捷的分析方法已經(jīng)成為研發(fā)人員關心的問題，隨著研究成果的逐漸成熟將極大推動該方法的臨床應用。其次，單細胞拉曼技術各項操作的標準化有待進一步建立。目前拉曼光譜檢測方法不統(tǒng)一，不同類型樣本背景信號對不同檢測方法的干擾存在差異，導致樣本的前期處理、參數(shù)設置等存在一定差異，這些差異極大地限制了在拉曼光譜技術臨床應用中的標準化。同種拉曼檢測方法的操作標準化、不同種檢測方法的結果差異比對將是拉曼光譜技術廣泛應用于臨床的最大問題。綜上所述雖然拉曼光譜技術存在一些問題但它在臨床病原微生物檢測上具有非培養(yǎng)、高保護性、高特異性、快速性、高效性、低成本和高效分離細胞建立微生物表型的優(yōu)勢，使其在臨床微生物檢測領域具有極大的發(fā)展?jié)撃?，值得深入研究?/p>