番茄堿的制備及其對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

姜曉霞，朱艷雯，周麗麗，趙 楠，劉 玲，岳喜慶，白 冰*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

甾體生物堿主要分布于夾竹桃科、天?？啤⑶芽坪桶俸峡浦参镏?，是植物的自我防御代謝產(chǎn)物。番茄中的甾體生物堿成分主要是番茄堿，其含量在番茄葉、花、莖、青果中依次降低[1]。番茄堿是一種具有抗菌[2-3]、抗病毒[4-5]、抗炎[6-7]、抗癌[8-10]等多種生理功能的活性分子[11]。

在膽堿能體系中，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）能將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿。AChE的過度激活可降低突觸中的乙酰膽堿水平，導(dǎo)致阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[12]。因此抑制AChE活性和上調(diào)乙酰膽堿水平是維持膽堿能系統(tǒng)平衡的關(guān)鍵。已有研究初步揭示了番茄堿的神經(jīng)保護(hù)作用，如番茄堿能通過保護(hù)線粒體膜電位和抑制氧化應(yīng)激的方式降低谷氨酸鹽對SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤的毒性，從而保護(hù)神經(jīng)[13]。另外，番茄堿還可以增加溶酶體活性，進(jìn)而對缺血性神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用[14]。番茄堿來源于食品，毒性低，通過番茄堿與AChE的相互作用探索番茄堿神經(jīng)保護(hù)活性的研究相對較少。本實驗從番茄葉中制備出番茄堿，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLCQTOF-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定并與標(biāo)準(zhǔn)品比對；利用紫外光譜法檢測番茄堿對AChE活性的影響；以分子熒光光度法及3D、2D分子對接技術(shù)進(jìn)一步揭示番茄堿與AChE相互作用方式，從而為番茄堿的神經(jīng)保護(hù)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄葉于2019年9月采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄種植基地。

番茄堿、茄堿 北京索萊寶公司；AChE（來源于電鰻） 美國Sigma-Aldrich公司；碘化硫代乙酰膽堿、5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）；其他試劑均為分析純 大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XD-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海賢德公司；5430R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；FD5-3P冷凍干燥機 美國SIM公司；UPLC-TOF-MS儀 美國Waters公司；AVANCE III 600 MHz NMR儀 德國Bruker公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄堿粗提物的制備

番茄堿提取方法參照文獻(xiàn)[15-16]。取烘干（70 ℃、8 h）并磨粉過篩（80 目）的番茄葉粉50.0 g，按一定料液比加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，超聲提取后抽濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10 mL，再加入體積分?jǐn)?shù)5% HCl溶液調(diào)pH值至2～3，加入等體積的無水乙醚萃取，經(jīng)萃取的溶液用濃氨水調(diào)pH值至10～11，冷凍離心30 min（10 000 r/min），沉淀繼續(xù)重復(fù)此酸溶堿沉操作3 次，得到的沉淀即為番茄堿粗提物。番茄堿提取量按式（1）計算。

1.3.2 單因素試驗

考察超聲條件中的料液比（m（番茄葉粉）∶V（體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液））（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（25、30、35、40、45 ℃）和pH值（8、9、10、11、12）4 個因素對番茄堿提取量的影響。做單因素試驗時，各固定因素分別為：料液比1∶15、超聲時間40 min、超聲溫度35 ℃、pH 10。

1.3.3 響應(yīng)面試驗

以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）和pH值（D）設(shè)計四因素三水平試驗，具體見表1。通過Design Expert 8.0.6軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Level and code of independent variables used for response surface design

1.3.4 番茄堿的純化

番茄堿的純化步驟參照文獻(xiàn)[1]，番茄堿粗提物經(jīng)Al2O3柱層析后收集目標(biāo)組分，凍干得到褐色粉末，于-20 ℃保存。

1.3.5 UPLC-QTOF-MS和1H NMR、13C NMR鑒定純化后的番茄堿樣品

參照文獻(xiàn)[17]采用UPLC-QTOF-MS鑒定番茄堿，純化后的番茄堿樣品溶于甲醇配制成質(zhì)量濃度為50 μg/L的溶液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣。

UPLC條件：ACQUITY UPLC C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸，B相為甲醇；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL；檢測波長205 nm。梯度洗脫色譜條件：0～0.2 min，90% A；0.2～6.0 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)遞減至10%；6～8 min，10% A；8.0～8.1 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)遞增至90%；8.1～10.0 min，90% A。

MS條件：電噴霧離子源正離子掃描模式；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度345 ℃；干燥氣體積流量3.0 L/min；脫溶劑溫度350 ℃；掃描范圍m/z100～1 200；二級裂解電壓20～45 eV。

NMR鑒定番茄堿：純化后的番茄堿樣品經(jīng)氘代二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO-d6）溶解配制成10 mg/mL的溶液，進(jìn)行NMR測定，采用MestReNova軟件分析結(jié)果。此部分實驗委托沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院測試中心進(jìn)行。

1.3.6 AChE活力測定及分子熒光光譜檢測

pH 7.0磷酸緩沖溶液（0.01 mol/L）配制所有試劑。將0.1 mg/mL AChE分別以體積比1∶1與0.25～1.00 mmol/L濃度范圍番茄堿或者0.6～1.0 mmol/L茄堿混合，37 ℃水浴20 min，作為酶處理液，同時以未作任何處理的0.1 mg/mL AChE溶液作對照。

AChE活力測定檢測參考文獻(xiàn)[18]。測定3 mL反應(yīng)體系（2.7 mL磷酸緩沖液、0.l mL 2.5 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿、0.l mL 3 mmol/L DTNB溶液及50 μL酶處理液），于412 nm波長處每10 s記錄吸光度，共檢測5 min，每組平行測定3 次。

分子熒光光譜檢測：酶處理液在激發(fā)波長280 nm下檢測發(fā)射波長300～700 nm處熒光光譜。番茄堿和茄堿本身無熒光效應(yīng)，不產(chǎn)生干擾。

1.3.7 酶抑制動力學(xué)分析

酶抑制動力學(xué)是通過酶催化反應(yīng)速率的變化規(guī)律來研究抑制劑對酶作用的機理[19]，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖基于米氏方程（式（2））。

式中：V0表示反應(yīng)初始速率/（mmol/（L·s））；Vm表示最大反應(yīng)速率/（mmol/（L·s））；[S]表示為底物濃度/（mmol/L）；Km表示米氏常數(shù)。

以1/[S]為橫坐標(biāo)，以1/V0為縱坐標(biāo)建立一條一次函數(shù)直線，其中橫坐標(biāo)截距絕對值的倒數(shù)為Km，縱坐標(biāo)截距的倒數(shù)則為Vm。

通過研究抑制劑對酶的Km和Vm的影響，可以確定抑制劑的抑制類型。當(dāng)Km增大，Vm不變，雙倒數(shù)曲線相交于縱坐標(biāo)時，該抑制類型為競爭性抑制；當(dāng)Km不變，Vm減小，雙倒數(shù)曲線相交于橫坐標(biāo)時，該抑制類型為非競爭性抑制；當(dāng)Km減小，Vm下降，Vm/Km不變，雙倒數(shù)曲線相互平行時，即該抑制類型為反競爭性抑制。

1.3.8 分子對接分析

番茄堿的立體結(jié)構(gòu)利用Chem3D Ultra 14.0軟件得到，乙酰膽堿酯酶的立體結(jié)構(gòu)利用Protein Data Bank得到的。3D分子對接使用Auto Dock程序完成，2D分子對接使用LigPlot程序完成[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Design Expert 8.0.6、MestReNova軟件，作圖采用OriginPro 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄堿的提取量

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

如圖1所示，隨料液比降低、超聲時間延長、超聲溫度升高、pH值增加，番茄堿提取量均先增加后降低，當(dāng)料液比1∶20、超聲時間40 min、超聲溫度40 ℃、pH值為11時，番茄堿提取量最高。

圖1 不同因素對番茄堿提取量的影響Fig.1 Effects of variables on the extraction yield of tomatidine from tomato leaves

2.1.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）及pH值（D）為自變量，以番茄堿提取量為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2，再采用Design Expert 8.0.6軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，得到表3和圖2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental results of response surface design

對表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸模擬，得到番茄堿提取量/（mg/100 g）＝23.22-0.10A+0.16B+0.63C-0.53D-0.31AB-0.25AC-0.22AD-0.085BC+0.42BD-0.35CD-0.64A2-0.97B2-1.30C2-0.73D2。如表3、圖2所示，一次項B影響顯著（P＜0.05），C、D影響極顯著（P＜0.01），A影響不顯著。交互項A×B、C×D影響顯著；B×D影響極顯著；A×C、A×D和B×C影響不顯著；二次項A2、B2、C2和D2均有極顯著影響。說明料液比、超聲時間、超聲溫度、pH值對番茄堿提取量的影響并非簡單的線性關(guān)系，存在復(fù)雜的交錯影響。綜合對比，影響效果由高到低順序為C（超聲溫度）＞D（pH值）＞B（超聲時間）＞A（料液比）。

圖2 不同因素的交互作用對番茄堿提取量的影響Fig.2 Response surface and contour plots showing interactive effects of variables on tomatidine extracts

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression model

2.1.3 優(yōu)化最佳工藝參數(shù)及驗證結(jié)果

依據(jù)響應(yīng)面分析，當(dāng)料液比1∶19.67、超聲時間39.85 min、超聲溫度41.54 ℃、pH值為10.56時，番茄堿的提取量為23.437 6 mg/100 g。工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比1∶20、超聲時間40 min、超聲溫度40 ℃、pH 11。采用調(diào)整后的工藝參數(shù)，3 次提取番茄堿量平均值為23.19 mg/100 g，說明響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2 番茄堿純化產(chǎn)物的UPLC-QTOF-MS分析

如圖3所示，經(jīng)UPLC-QTOF-MS分析，純化后的產(chǎn)物保留時間為10.0 min，其[M+H]+m/z為416.267 6，比對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定產(chǎn)物為番茄堿（C27H45NO2，m/z415.65）。并用番茄堿標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品進(jìn)行定量分析，測得純度約為90%。m/z398.260 3、m/z273.164 7和m/z255.157 7均由[M+H]+m/z416.267 6裂解而來。m/z398.260 3是由[M+H]+m/z416.267 6脫水形成；m/z273.164 7是由[M+H]+m/z416.267 6環(huán)碎裂產(chǎn)生的；m/z255.157 7是由m/z273.164 7進(jìn)一步失水得到的[21]。以上結(jié)果可進(jìn)一步證明純化后的產(chǎn)物為番茄堿。

圖3 番茄堿的UPLC-QTOF-MS解析Fig.3 Analysis of tomatidine by UPLC-QTOF-MS

2.3 NMR結(jié)果分析

采用NMR法對純化后的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，結(jié)果如圖4所示。對1H和13C進(jìn)行標(biāo)峰，并對峰面積進(jìn)行積分，通過化學(xué)位移和積分面積確定氫原子和碳原子的位置及數(shù)量，具體分析結(jié)果見表4。該化合物共含有45 個氫原子和27 個碳原子，與番茄堿的結(jié)構(gòu)相吻合，因此確定該化合物為番茄堿。

表4 純化后產(chǎn)物1H NMR和13C NMR的數(shù)據(jù)歸屬（DMSO，600 MHz）Table 4 1H NMR and 13C NMR data assignment of the purified product(DMSO, 600 MHz)

圖4 純化后產(chǎn)物的1H NMR（A）和13C NMR（B）譜圖（600 MHz，DMSO）Fig.4 1H NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of the purified product(600 MHz, DMSO)

2.4 番茄堿對乙酰膽堿酯酶活性的影響及其酶動力學(xué)分析結(jié)果

由圖5A、B可知，番茄堿（0.125～0.5 mmol/L）和茄堿（0.3～0.5 mmol/L）在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)對AChE活性均有抑制效果，且存在濃度依賴關(guān)系；該現(xiàn)象與Jiang Bo等[22]報道的駱駝蓬中的去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿能夠抑制正常大鼠腦內(nèi)AChE活性的結(jié)論相一致。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行酶動力學(xué)分析（圖5C、D），隨著番茄堿、茄堿濃度的增大，均有Vm不變、Km增大的現(xiàn)象，說明番茄堿、茄堿對AChE的抑制均為競爭性抑制。

圖5 番茄堿、茄堿對AChE活力的影響Fig.5 Effects of tomatidine and solanine on the activity of AChE

2.5 分子熒光光譜和分子對接解析番茄堿與乙酰膽堿酯酶的相互作用

AChE中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）具有內(nèi)源性熒光特性，其熒光強度比為100∶9∶0.5[23-24]。如圖6A、B所示，AChE在激發(fā)波長為280 nm處，熒光發(fā)射波長約為340 nm。添加番茄堿后，340 nm處熒光強度降低，并且隨著番茄堿濃度增加，出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象，熒光發(fā)射波長由340 nm轉(zhuǎn)移至378 nm（番茄堿濃度0.25 mmol/L）和390 nm（番茄堿濃度0.5 mmol/L）處。推測帶苯環(huán)的氨基酸可能與番茄堿發(fā)生了相互作用，通過形成氫鍵或者形成疏水相互作用的方式，導(dǎo)致蛋白部分解折疊，弱化了340 nm波長處的熒光強度并使其紅移。與番茄堿不同，茄堿僅降低了AChE的熒光強度，并沒有出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象。

如圖6C所示，經(jīng)3D分子對接分析，番茄堿會與AChE的催化活性中心的Trp86產(chǎn)生一個氫鍵，距離為2.6 ?。而Trp86正是AChE與底物膽堿的結(jié)合位點，也就是說，番茄堿是通過與AChE蛋白上底物結(jié)合位點中Trp86形成氫鍵的方式，競爭性地干擾了AChE與底物乙酰膽堿的結(jié)合，從而部分抑制AChE的催化活性。如圖6D所示，利用2D分子對接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)番茄堿與AChE蛋白中的Ser293、Phe295、Phe338、Phe297、Ser125、Gly121、Ser203、Glu202、Gly120、His447、Gly448、Ile451、Trp86、Tyr124、Tyr337、Tyr341、Ile294可以形成疏水相互作用，這些新生成的疏水作用改變了AChE周圍的微環(huán)境，也進(jìn)一步解釋了番茄堿是通過形成疏水相互作用的方式弱化AChE蛋白在340 nm波長處的熒光強度并使其紅移。綜上，番茄堿主要通過與AChE蛋白上底物結(jié)合位點部分氨基酸殘基形成氫鍵和疏水相互作用的方式起到部分抑制AChE活性的目的。

3 結(jié) 論

本研究采用超聲波提取法提取番茄葉中的番茄堿，通過UPLC-QTOF-MS和NMR法鑒定純化后的產(chǎn)物為番茄堿，采用紫外光譜法和酶動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)番茄葉中提取的番茄堿具有部分抑制AChE活性，且其抑制類型為競爭性抑制。2D、3D分子對接技術(shù)闡明番茄堿是通過與AChE蛋白Trp86形成氫鍵方式，同時與多個疏水氨基酸形成疏水相互作用，競爭性地干擾了AChE與底物的結(jié)合，說明形成氫鍵與疏水相互作用為番茄堿抑制AChE活性的主要方式。