基于Rho/ROCK通路觀察鹽酸小檗堿干預(yù)心肌肥厚作用機(jī)制研究

寇涂利 ，尹立雪,，羅浩柔 ，沈 陽(yáng)

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科,四川 成都 610072；3.成都市第七人民醫(yī)院,四川 成都 610000)

心肌肥厚作為一種心臟超負(fù)荷的代償性反應(yīng)，和許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，心肌肥厚最初是維持正常血液循環(huán)的代償機(jī)制，但持續(xù)的肥厚不僅能刺激膠原合成，促進(jìn)間質(zhì)纖維化，并且還能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活化，從而降解膠原，最終會(huì)導(dǎo)致充血性心力衰竭和猝死[2]。心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭和猝死的主要原因之一，因此，阻斷心肌肥厚是防治心臟重構(gòu)、改善心肌功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。有研究表明，某些植物化學(xué)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路從而抑制病理性心肌肥厚，主要包括蛋白激酶C(PKC)通路、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)通路和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路等[4]。作為被廣泛研究的中草藥，鹽酸小檗堿已被證明具有多種藥理作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、降血脂等[5]。有研究稱其能有效抑制病理性肥厚，然而其作用機(jī)制尚不明確[6]。本研究于2021年4～9月采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型，擬觀察鹽酸小檗堿對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的影響及其抗心肌肥厚的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SD大鼠(230～270克)，SPF級(jí)，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(SCXK 2020-030)。大鼠在恒溫條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲食和飲水。本工作獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及器材ISO(貨號(hào)：HY-B0468)、蘇木素染液(批號(hào)：ZH193907)均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。伊紅染液(批號(hào)：C200403)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。改良Masson三色染色液(批號(hào)：0227A21)購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。ROCK(批號(hào)：AF7016)、 RchoA(批號(hào)：AF6352)、PTEN(批號(hào):AB31392)，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TGFβ1(批號(hào):BS-20411R)抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。生物素二抗：山羊抗兔工作液(批號(hào)：SP-9001)，購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。心臟超聲儀器(Vivid E9)美國(guó)GE公司。圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、較低劑量干預(yù)組、較高劑量干預(yù)組，每組10只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，除了正常組對(duì)照以外，其余組大鼠予以腹腔注射3 mg/kg異丙腎上腺素建立心肌肥厚模型，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水7天。建模后12小時(shí)，分別予以較低劑量干預(yù)組、較高劑量干預(yù)組大鼠5、10 mg/kg鹽酸小檗堿灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。

1.3.2超聲數(shù)據(jù)采集 所有大鼠的超聲圖像在基線時(shí)、成功建模后和給藥后2周后收集。將大鼠置于左側(cè)臥位并固定在檢查床上，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。連接同步肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖獲得超聲參數(shù)。使用12 S(12 MHz)相控陣兒科換能器,頻率為10 MHz，深度為2 cm，幀率為每秒220幀。在乳頭肌水平獲得的標(biāo)準(zhǔn)二維短軸圖像被數(shù)字化存儲(chǔ)。記錄舒張末期心室間隔(IVS)厚度、左心室后壁厚度(LVPW)，所有參數(shù)測(cè)量3次，取平均值。

1.3.3病理學(xué)觀察 圖像采集后，每組分別隨機(jī)處死3只大鼠。左心室心肌用10%多聚甲醛固定，切片用蘇木精和伊紅染色，觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)和壞死程度；Masson三色染色觀察心肌纖維化程度。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4各組大鼠心肌組織Rho/ROCK信號(hào)通路因子表達(dá)量 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè) RhoA、ROCK、TGF-β1、P-PTEN蛋白表達(dá)情況。 固定標(biāo)本、包埋、切片，使用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化以及3%甲醇雙氧水滅活后行抗原修復(fù)。 一抗4 ℃孵育12 h后滴加二抗,然后使用DAB顯色試劑盒，混勻試劑后滴加到切片上，室溫顯色。用顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行圖像采集,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定所采集全部圖像的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，并計(jì)算每張圖像的平均光密度(Mean density，MD)，以平均來(lái)評(píng)價(jià)蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。四組大鼠建模前后、干預(yù)前后采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組大鼠未見明顯異常；在建立給予腹腔注射異丙腎上腺素期間，模型組大鼠、較低劑量干預(yù)組、較高劑量干預(yù)組分別猝死2只、1只、1只，最終總共36只大鼠被納入統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 常規(guī)超聲數(shù)據(jù)四組大鼠基線IVS、LVPW值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組大鼠的IVS、LVPW值無(wú)明顯變化(P>0.05)。其余組大鼠的IVS、LVPW值在模型建立后顯著增加(均P< 0.05)。在相應(yīng)干預(yù)后，較高劑量組大鼠的IVS值、LVPW值較前降低(P<0.05)，較低劑量組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且較高劑量組低于較低劑量組和模型組。見表1。

表1 四組大鼠基線、建模成功及干預(yù)2周后IVS、LVPW值比較 (mm)

2.3 病理結(jié)果正常對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整清晰，心肌纖維形態(tài)正常。而模型組大鼠心肌細(xì)胞顯著增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維化加重。與模型組相比，干預(yù)組大鼠上述心肌病理均有所緩解，結(jié)構(gòu)更完整，以較高劑量組明顯。馬松染色可見，與正常對(duì)照組相比，其余三組均出現(xiàn)不同程度的心肌纖維化，纖維組織明顯增生；與模型組相比，干預(yù)組大鼠心肌纖維化程度均有所減輕；與較低劑量組相比，較高劑量組心肌纖維化程度進(jìn)一步減輕。鹽酸小檗堿能在一定程度上減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的膠原纖維增生。

2.4 大鼠心肌組織 Rho/ROCK信號(hào)通路蛋白量比較與正常對(duì)照組相比，其余三組大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達(dá)量升高，P-PTEN蛋白表達(dá)量均有所降低(均P<0.05)。此外，與模型組相比，較低劑量組和較高劑量組大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達(dá)量均有所降低，P-PTEN蛋白表達(dá)量均有所升高(均P<0.05)；與較低劑量組相比，較高劑量組RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達(dá)量進(jìn)一步降低，P-PTEN蛋白表達(dá)量進(jìn)一步升高(均P<0.05)。見表2、圖1。

表2 四組大鼠心肌組織Rho/ROCK通路蛋白量

圖1 四組大鼠心肌組織P-PTEN、TGF-β1、ROCK 、RhoA免疫染色結(jié)果 (×200)

3 討論

心力衰竭是一種全球性流行病，全世界估計(jì)有2600萬(wàn)人受到影響，也正在成為亞洲最常見的心臟病之一，5年和10年死亡率分別為50%和90%[7]。心肌肥厚是心力衰竭的最主要形式，病理性心肌肥厚可由高血壓、心肌梗死和瓣膜性心臟病引起[8]。心臟的壓力或容量超負(fù)荷(例如，由于高血壓或瓣膜紊亂)可誘導(dǎo)心肌肥大，這最初是一種代償性反應(yīng)，但持續(xù)的超負(fù)荷最終會(huì)導(dǎo)致充血性心力衰竭、心律失常和猝死[2]。此外，氧化應(yīng)激、能量代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)因素、神經(jīng)體液因子、心血管自分泌/旁分泌因子、胰島素抵抗、microRNA和遺傳學(xué)等多層次復(fù)雜因素參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。盡管心肌肥厚的確切分子機(jī)制仍不完全清楚，但在心臟疾病的早期階段提供正確的治療可能會(huì)誘導(dǎo)左心室恢復(fù)其正常的功能和結(jié)構(gòu)[9]。因此，尋找新的化合物延緩或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚是很重要、迫切的。

小檗堿是一種異喹啉生物堿，廣泛存在于小檗科、罌粟科、貓爪草、茜草科、半月板花屬植物中，是中藥的組成部分，具有多種藥理作用。它最初被用于治療腸道炎癥，因?yàn)樗哂酗@著的抗微生物活性和抗炎、抗增殖、抗纖維化等特性[10]。小檗堿已成為治療心血管、內(nèi)分泌和腸道疾病的有效藥物[11]。有研究表明，植物化學(xué)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路從而抑制病理性心肌肥厚，主要包括PKC通路、CaN通路和MAPK通路等[12]。在近期的報(bào)道中稱鹽酸小檗堿可有效抑制心肌肥厚[6]，然而其作用機(jī)制尚不明確。

大鼠的心臟通常被用作人類健康和疾病狀態(tài)下的心臟實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚13]，β-腎上腺素受體的持續(xù)激活可誘導(dǎo)病理性心肌肥厚、心肌纖維化和心肌缺血。ISO是一種強(qiáng)大的合成非選擇性β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，已被廣泛用于心肌肥厚模型[14]。本研究中，給予大鼠腹腔注射3 mg/kg的異丙腎上腺素7天后，可觀察到心肌IVS、LVPW厚度均明顯升高，且在病理下可以觀察到大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、心肌細(xì)胞顯著增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生明顯，顯示在研究中ISO誘導(dǎo)了典型的心肌肥厚模型。

心力衰竭是最常見的心血管疾病且是大部分心血管疾病的終末階段，在細(xì)胞水平上，心肌肥厚的特征是細(xì)胞增大和胎兒基因程序的重新激活，以及細(xì)胞骨架的重組[15]。心肌肥厚作為心力衰竭的生物學(xué)基礎(chǔ)受多種信號(hào)通道調(diào)控，如Akt、 P13K、MAPK、AMPK、GPCRs等信號(hào)通路，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路可以調(diào)控整個(gè)心肌肥厚過程達(dá)到改善或逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的目的，繼而治療心力衰竭[16]。Rho/Rock信號(hào)通路是體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，RhoA是Rho蛋白家族的主要成員，而Rho激酶(ROCK)為Rho下游靶效應(yīng)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[17]，能接受Rho傳遞的信號(hào)，激活ROCK能使多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，并介導(dǎo)下游一系列的磷酸化與脫磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)異常高表達(dá)的Rho會(huì)引起心肌肥厚、心室重塑、心肌功能下降及心力衰竭[19]。腫瘤抑制因子P-PTEN在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞廣泛表達(dá)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡調(diào)控有關(guān)，PTEN能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大及存活，越來(lái)越多的研究證實(shí)，心肌細(xì)胞中PTEN的特異性失活導(dǎo)致心肌肥厚，有報(bào)道稱敲除PTEN基因可致心肌肥厚，并減低心肌的收縮性[20，21]。在本研究中我們可以觀察到由異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠，其IVS和LVPW均明顯增厚，且心肌組織中RhoA和ROCK的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組大鼠，說(shuō)明Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與心肌肥厚肥厚過程，而使用較高劑量鹽酸小檗堿干預(yù)后，可以發(fā)現(xiàn)心肌IVS、LVPW厚度減輕，在較低劑量組中也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這時(shí)心肌組織中RhoA和ROCK的表達(dá)量均有所降低，說(shuō)明鹽酸小檗堿可能通過抑制Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而改善心肌肥厚，且在抑制該通路上可能存在劑量依賴性。

心臟纖維化是許多心血管疾病常見病理特征，并且是參與心血管疾病惡化過程的重要因素[22]。Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠調(diào)控細(xì)胞增殖，參與組織損傷修復(fù)和再生，在心肌纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[17]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1是目前能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成最為明顯的細(xì)胞因子之一[23],TGF-β1已被證實(shí)是Rho/ROCK信號(hào)通路的上游激活因素，而ROCK又可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞大量釋放TGF-β1促進(jìn)纖維化[19]。在病理觀察下可以發(fā)現(xiàn)到由異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠均出現(xiàn)不同程度的心肌纖維化，其TGF-β1表達(dá)均有所升高，而在使用鹽酸小檗堿干預(yù)后的大鼠心肌組織中，心肌纖維化程度減輕，TGF-β1表達(dá)均有所降低，提示鹽酸小檗堿可以通過抑制Rho/ROCK信號(hào)通路、降低TGF-β1表達(dá)從而減輕心肌纖維化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。這也與陳志冬等[24]的發(fā)現(xiàn)相一致。本研究結(jié)果也說(shuō)明了TGF-β1參與心肌肥厚和左心室纖維化，這也和既往的研究相符[25]。

綜上所述，本研究提示鹽酸小檗堿能改善心肌肥厚，抑制心肌纖維化，其機(jī)制可能與是抑制Rho/ROCK通路、調(diào)整TGF-β1、P-PTEN表達(dá)量有關(guān)。