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      新型多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}對肝癌SK-HEP-1細胞的抑制作用

      2022-02-15 08:24:48祝欣萍林少輝李婧銥趙煒明
      癌變·畸變·突變 2022年1期
      關(guān)鍵詞:焦亡孔板肝癌

      祝欣萍,賈 迪,林少輝,劉 晨,李婧銥,趙煒明,2,*

      (1.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

      肝癌是源于肝細胞和肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析,全世界每年約有90.5萬例肝癌新發(fā)病例和83萬例肝癌引起的死亡病例[1-2]。手術(shù)切除、肝移植、局部消融、化學治療是肝癌患者的主要治療方式[3]。索拉菲尼、阿霉素、順鉑等藥物作為臨床治療肝癌常見的化療藥物[4],長期使用可產(chǎn)生嚴重毒副作用并可引起腫瘤耐藥[5]。因此,探尋新型低毒、高效的抗癌藥物具有重要意義。

      多金屬氧酸鹽(polyoxometalates,POMs)是由前過渡金屬離子通過氧連接而形成的一類多金屬氧簇化合物[6]。POMs藥物具有低毒性、高活性的特點,能顯著抑制腫瘤生長和血管生成[7],是抗癌治療的潛在候選藥物。多項研究表明[8-11],POMs藥物對包括胰腺癌、白血病、肝細胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌在內(nèi)的多種腫瘤均有治療作用。2020年,Razavi等[7]合成的高負電荷Preysler POM負載納米脂質(zhì)體可抑制人肝癌HepG2細胞的生長并促進細胞凋亡。同年,Joshi等[12]合成了一種新型的多鉬酸鹽基有機-無機雜化固體并通過誘導MCF-7、A549和HepG2細胞的凋亡和壞死途徑最終導致癌細胞死亡。2021年,孫宏斌等[13]發(fā)現(xiàn)多金屬氧酸鹽SbW9能抑制非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和PC9的增殖并誘導其凋亡。

      {BiW8O30}是通過新型有機配體及非貴金屬雜原子修飾的多金屬氧酸鹽藥物,分子式為Na6H4[Bi2W20Co2O70(H2O)6]·34H2O。通過綜合運用細胞生物學、分子生物學和生物信息學技術(shù),本研究團隊發(fā)現(xiàn)了{BiW8O30}具有激活肉瘤細胞焦亡、上調(diào)活性氧水平、抑制DNA修復等多重作用[14]。但尚未有研究者將{BiW8O30}應用于肝癌中,故本研究以肝癌SK-HEP-1細胞為研究對象,探討{BiW8O30}對體外培養(yǎng)的肝癌細胞增殖、集落形成、遷移、侵襲及凋亡的作用,為肝癌治療藥物的研發(fā)提供新的思路。

      1 材料與方法

      1.1 細胞株與主要試劑

      人肝癌細胞系SK-HEP-1購于中國科學院細胞庫,RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司;胎牛血清購于BI公司;胰酶細胞消化液、青-鏈霉素混合液購于碧云天公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于BioFroxx公司;CCK-8試劑盒購于SEVEN公司,Transwell小室與孔板均購于BioFil公司;Matrigel基質(zhì)膠(356234)購于Corning公司;DAPI和Annexin VAlexa Fluor488/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于四正柏生物;多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}由哈爾濱理工大學宮麗閣課題組提供。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 細胞培養(yǎng) SK-HEP-1細胞采用含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數(shù)5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每2~3 d換液1次;待細胞生長至匯合度達70%~80%時按1∶3的比例傳代,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

      1.2.2 {BiW8O30}溶液配制 精確稱取{BiW8O30}藥物0.012 4 g,溶于5 mL細胞培養(yǎng)基(超聲破碎儀使藥物完全溶解),0.22μm的濾膜過濾即為400μmol/L的無菌母液。使用時用細胞培養(yǎng)基稀釋至不同處理濃度。

      1.2.3 細胞增殖實驗 常規(guī)消化SK-HEP-1細胞并調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL,接種于96孔板并鋪勻,于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細胞貼壁且生長匯合度為70%~80%時,設置4個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)24和48 h。終止培養(yǎng)后,加入10μL的CCK-8指示劑,孵育2 h后于450 nm處測定吸光度值D(450),并計算細胞存活率和半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。IC50通過GraphPad Prism進行計算。

      1.2.4 細胞集落形成實驗 SK-HEP-1細胞常規(guī)消化后按500個/mL的濃度接種于6孔板并孵育過夜。待細胞貼壁,設置3個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)2周。待6孔板中有明顯的細胞集落形成,進行染色、拍照。通過ImageJ計數(shù)集落形成數(shù)。

      1.2.5 細胞劃痕實驗 SK-HEP-1細胞以5×105個/mL的濃度均勻接種于6孔板并孵育過夜。待細胞貼壁且生長匯合度達90%以上,用10μL槍頭末端在6孔板中央劃痕,PBS清洗2次。設置3個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200 μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后0、24、48 h在同一位置進行拍照。通過ImageJ測量劃痕愈合面積S。

      1.2.6 Transwell實驗 Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1∶8的比例稀釋混勻,取45μL均勻鋪到Transwell小室中孵育過夜。待膠凝固,常規(guī)消化SKHEP-1并調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL,設置3個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基。200μL細胞懸液接種于上室,600μL含10%血清的培養(yǎng)基加入下室,分別培養(yǎng)24和48 h。培養(yǎng)終止后,棄掉培養(yǎng)基,棉簽擦掉上室未穿膜的細胞,甲醇固定60 min,0.1%的結(jié)晶紫染色8 min,PBS淋洗2次,鏡下隨機選取5個視野進行拍照計數(shù),觀察細胞侵襲情況。通過ImageJ計數(shù)侵襲細 胞數(shù)。

      1.2.7 DAPI染色 常規(guī)消化SK-HEP-1并調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,均勻鋪到6孔板中并孵育過夜。待細胞貼壁,設置3個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。然后PBS清洗2次,4%多聚甲醛-20℃固定15 min,PBS沖洗2次,室溫避光染色10 min,PBS沖洗后,于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

      1.2.8 DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI熒光染色 SK-HEP-1細胞以1×105個/mL的細胞濃度均勻接種于6孔板并孵育過夜。待細胞貼壁,設置3個不同濃度的實驗組,分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液,對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。完成凋亡刺激后,預冷PBS洗滌兩次,1 000 r/min離心5 min,200μL的Binding Buffer重懸。依次加入DAPI、Annexin V和PI,室溫避光反應30 min,滴1滴反應液于載玻片上,熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

      1.3 統(tǒng)計學方法

      本研究所有實驗均重復3次及以上,數(shù)據(jù)均采用±s表示。統(tǒng)計分析軟件包括ImageJ、GraphPad Prism,組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)進行統(tǒng)計分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果

      2.1 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細胞的體外增殖能力

      細胞增殖實驗結(jié)果見圖1,{BiW8O30}作用SKHEP-1細胞24和48 h的IC50分別為(102.07±1.38)、(74.68±0.91)μmol/L。與 對 照組相比,50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后,SK-HEP-1細胞存活率分別降低了29.98%、51.29%、65.81%、83.59%;48 h后SK-HEP-1細胞存活率分別降低了31.57%、66.23%、81.88%、83.97%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明{BiW8O30}顯著抑制人肝癌SK-HEP-1細胞的體外增殖能力。

      圖1 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細胞的體外增殖能力

      2.2 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細胞的集落形成能力

      細胞集落形成實驗結(jié)果見圖2,與對照組相比,50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理后,SK-HEP-1細胞的集落形成數(shù)顯著減少,分別降低了28.57%、63.27%、90.82%,表明{BiW8O30}對SK-HEP-1細胞的集落形成能力具有顯著的抑制作用。

      2.3 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細胞的遷移和侵襲能力

      劃痕實驗結(jié)果見圖3,與對照組相比,50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后,SK-HEP-1細胞的劃痕愈合率降低了8.47%、70.59%、80.83%;48 h后,SK-HEP-1細胞的劃痕愈合率降低了19.56%、65.98%、75.49%。Transwell實驗結(jié)果見圖4,與對照組相比,50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理后,24 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的SK-HEP-1細胞數(shù)量降低了27.74%、45.51%、68.77%;48 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的SKHEP-1細胞數(shù)量降低了47.03%、72.20%、84.07%。以上結(jié)果提示{BiW8O30}可顯著抑制SK-HEP-1細胞的遷移和侵襲能力。

      圖2 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細胞的體外集落形成能力

      圖3 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細胞的體外遷移能力

      圖4 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細胞的體外侵襲能力

      2.4 {BiW8O30}誘導人肝癌SK-HEP-1細胞凋亡

      DAPI染色結(jié)果(圖5A)顯示,與對照組相比,50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后,SKHEP-1細胞的數(shù)量減少、體積減小,細胞核濃縮、破裂增多。DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI三重熒光染色實驗結(jié)果(圖5B)顯示,對照組中藍色熒光信號較強可見,幾乎未檢測到綠色和紅色熒光信號,即活細胞較多,而凋亡細胞很少;50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理SK-HEP-1細胞24 h后,檢測到較強的綠色和紅色熒光,即活細胞減少,凋亡細胞增多。以上結(jié)果表明{BiW8O30}誘導肝癌SK-HEP-1細胞凋亡。

      圖5 {BiW8O30}誘導SK-HEP-1細胞的凋亡

      3 討論

      肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[15],由于具有發(fā)病隱匿、早期無典型臨床癥狀的特點,肝癌患者往往被確診時即為肝癌晚期。作為肝癌患者的主要治療手段,常見的化療藥物如索拉菲尼、阿霉素、順鉑等,能夠在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量[16]。然而,長期使用化療藥物可對人體的器官造成嚴重毒副作用,同時也可引發(fā)腫瘤產(chǎn)生耐藥性,嚴重影響療效[1]。因此,迫切需要開發(fā)具有藥物療效和安全性的新藥物以改善肝癌的治療。本課題組前期研究表明,新型多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}在肉瘤治療中具有顯著抗腫瘤作用[15]。為探究該藥物是否適用于其他腫瘤,本研究首次將多金屬氧酸鹽藥{BiW8O30}應用于肝癌細胞。結(jié)果顯示{BiW8O30}可通過抑制肝癌細胞的增殖、集落形成、遷移、侵襲和誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

      本研究采用CCK-8法細胞增殖實驗,檢測{BiW8O30}對肝癌細胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加,細胞增殖能力被顯著抑制,且呈劑量依賴性降低。IC50為藥物抑制細胞生長50%所需濃度。已有研究發(fā)現(xiàn),臨床常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作用肝癌SK-HEP-1細胞24 h的IC50為115μmol/L[17],而本研究中{BiW8O30}作用肝癌SK-HEP-1細胞24 h的IC50為(102.07±1.38)μmol/L。這一結(jié)果表明{BiW8O30}在肝癌治療中具有較大潛力。在前期研究中,{BiW8O30}作用肉瘤細胞MG-63的IC50為127.3μmol/L[15],這提示{BiW8O30}對肝癌細胞具有更強的細胞毒作用,也表明{BiW8O30}可能具有治療多種腫瘤的潛力。細胞集落形成實驗結(jié)果顯示,{BiW8O30}顯著抑制了肝癌細胞干細胞特性和增殖能力。已有的關(guān)于多金屬氧酸鹽藥物抗肝癌作用的研究,主要采用低轉(zhuǎn)移潛能的HEP-G2肝癌細胞株。而本研究對象SK-HEP-1具有較高的侵襲與轉(zhuǎn)移潛能,惡性程度較高,利于研究藥物對肝癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示,隨著{BiW8O30}作用濃度和作用時間的增加,肝癌SK-HEP-1細胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制,提示{BiW8O30}可能抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。

      形態(tài)學觀察顯示,{BiW8O30}給藥后,肝癌細胞發(fā)生了細胞皺縮、體積減小、細胞核固縮碎裂以及形成凋亡小體等改變,提示{BiW8O30}可誘發(fā)肝癌細胞凋亡。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn){BiW8O30}抗肉瘤作用的方式之一是誘導肉瘤焦亡。同一種藥物誘導出兩種不同的死亡方式,引起了我們極大的興趣。近年來,隨著對細胞死亡方式的深入研究[18],研究者發(fā)現(xiàn)不同類型的程序性死亡可以歸納為一個單一的、協(xié)調(diào)的細胞死亡系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中,細胞內(nèi)各信號通路高度相互關(guān)聯(lián),相互補償。2019年Malireddi等[19]發(fā)現(xiàn)了一條新型細胞死亡途徑,稱為PANopossis,此通路由PANoptosome復合體調(diào)控,焦亡、凋亡和程序性壞死同時參與。

      凋亡、焦亡、程序性壞死是細胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)中的3個關(guān)鍵途徑。其中,凋亡由半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活、調(diào)亡小體的形成介導,焦亡由炎性小體的調(diào)節(jié)、Gasdermin家族成員的激活介導,程序性壞死由RIPK1、RIPK3和MLKL的激活,胞質(zhì)壞死小體的形成介導[20]。3條途徑既能獨立激活,又能相互關(guān)聯(lián)[21]。如凋亡和焦亡通路的介導均依賴Caspase家族成員的激活,焦亡和程序性壞死的發(fā)生均有炎性因子的釋放,凋亡、焦亡、程序性壞死均有脂質(zhì)過氧化的參與等。以往的大部分研究都集中在個別的細胞死亡方式上,而不同的PCD途徑是否是獨立發(fā)生的尚不清楚,仍有待進一步研究。結(jié)合本課題組前期研究和上述結(jié)果,{BiW8O30}是否通過誘導腫瘤細胞多種死亡方式,從而起到抗腫瘤作用,其機制又是否與PANoptosis新型死亡途徑相關(guān),有待我們進一步探究。

      綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)新型多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}對肝癌SK-HEP-1細胞的體外抗腫瘤作用。{BiW8O30}可顯著抑制肝癌細胞SK-HEP-1的增殖、遷移和侵襲能力,并可誘導細胞凋亡。本研究為今后該藥物在肝癌治療中的臨床應用提供了實驗依據(jù),具有重要現(xiàn)實意義和臨床價值。

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