TPX2在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義

彭友彬，林 浩，黎 明，黃海花*

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 汕頭 515065；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515065)

膀胱癌在全世界與癌癥相關(guān)的死亡原因中排第9位，也是人類泌尿系統(tǒng)第二常見(jiàn)的惡性腫瘤。研究顯示，在2020年，大約有81 400例新診斷的膀胱癌病例和17 980例膀胱癌相關(guān)死亡患者，這給全球各個(gè)國(guó)家?guī)?lái)了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。根據(jù)腫瘤是否浸潤(rùn)膀胱肌層，膀胱癌可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，75%的膀胱癌患者初診時(shí)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，但超過(guò)50%的患者在短期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，此外，有10%~20%會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[2-3]。由于生物學(xué)特性不同，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌在疾病進(jìn)展、總體生存率和治療方面均存在較大差異[4]。如何在早期準(zhǔn)確預(yù)測(cè)哪些非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者有可能進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌是目前膀胱癌患者術(shù)后管理的關(guān)鍵問(wèn)題之一。因此，識(shí)別在膀胱癌早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中有意義的生物標(biāo)志物具有重要意義。

越來(lái)越多的研究表明，染色體的不穩(wěn)定性在腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為癌基因的異常擴(kuò)增或者抑癌基因的缺失[5-6]。Xklp2靶蛋白(Xklp2 target protein，TPX2)是一種受細(xì)胞周期調(diào)控的核增 殖相關(guān)蛋白，對(duì)細(xì)胞由G1/S期向G2/M期轉(zhuǎn)變至關(guān)重要[7]。近年來(lái)，隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)TPX2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤的分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后不良的分子標(biāo)記物[8-10]。但目前TPX2與膀胱癌的關(guān)系尚不甚明確。為進(jìn)一步闡明TPX2在膀胱癌中的作用，本課題擬探索TPX2在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)情況及其表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)及患者預(yù)后的關(guān)系，并探討其在膀胱癌中的作用，為膀胱癌的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TPX2 mRNA的表達(dá)

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)是一個(gè)由中國(guó)團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的用于癌癥和正?；虮磉_(dá)譜分析的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，其數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的9 736例腫瘤和8 587例正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Expression on Box Plot”功能模塊分析TPX2 mRNA在膀胱癌中的表達(dá)，再通過(guò)“Expression on Stage Plot”及“Survival Plots”功能模塊分析TPX2 mRNA的表達(dá)水平與膀胱癌患者腫瘤分期及預(yù)后的關(guān)系。

1.2 膀胱癌患者臨床資料

本研究納入的60例石蠟標(biāo)本選自2015年1月—2019年5月在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科接受治療的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者，男性48例，女性12例，60歲以上28例，≤60歲32例，納入標(biāo)準(zhǔn)為：①初發(fā)且經(jīng)病理證實(shí)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌；②手術(shù)方式均為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)；③術(shù)前未行任何其他治療(如新輔助化療等)；④術(shù)后均規(guī)律行吡柔比星膀胱灌注化療；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①患者合并其他惡性腫瘤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②患者短期內(nèi)行二次經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)；③患者合并有膀胱結(jié)石。本文定義：石蠟切片病理證實(shí)為尿路上皮癌的膀胱腫瘤組織為癌組織，病理提示無(wú)癌細(xì)胞參與的腫瘤基底為基底組織?；颊唠S訪方案如下：術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次，2年后為每半年1次；復(fù)查主要內(nèi)容為膀胱鏡檢查或是泌尿系彩超檢查，必要時(shí)行盆腔CT檢查；術(shù)后患者行膀胱鏡檢查或影像學(xué)檢查提示膀胱內(nèi)新生物為復(fù)發(fā)。本研究方案經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，且所有病例患者均簽署知情同意書(shū)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TPX2蛋白在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)

TPX2鼠單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒(KIT-9710)購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

膀胱癌組織及基底組織離體后立即經(jīng)10%中性甲醛固定，24 h后用梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟，再用石蠟包埋并切片。然后將切好的石蠟切片放入烤箱中60℃烘烤2 h，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后、微波抗原修復(fù)、過(guò)氧化氫阻斷及封閉，孵育TPX2抗體(1∶150稀釋)后置于4℃冰箱，過(guò)夜后孵育二抗，再經(jīng)DAB顯色及蘇木素染核后梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果判定

所有組織切片染色結(jié)果均經(jīng)2位病理專業(yè)人員以盲法分析確定。TPX2蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為組織細(xì)胞核被染色為淺棕色至深褐色。免疫組化切片評(píng)分采用半定量方法。首先按陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)著色計(jì)0分，輕度著色計(jì)1分，深度著色計(jì)2分；再按陽(yáng)性細(xì)胞占比進(jìn)行評(píng)分：＜10%計(jì)1分，10%(含)~50%計(jì)2分，≥50%以上計(jì)3分；并定義陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分的乘積為T(mén)PX2的表達(dá)，總分在0~6分。以＜2分為T(mén)PX2蛋白陰性表達(dá)，≥2分為T(mén)PX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析。TPX2蛋白的表達(dá)水平與腫瘤臨床病理指標(biāo)的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，TPX2與患者生存預(yù)后的關(guān)系則用Kaplan-Meier生存分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TPX2 mRNA在膀胱癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)“Expression on Box Plot”功能模塊分析結(jié)果提示TPX2 mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)“Expression on Stage Plot”功能模塊分析結(jié)果提示TPX2 mRNA在T2~T4期膀胱癌組織中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.247，如圖2A)；“Survival Plots”功能模塊分析提示TPX2 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)組患者的總體生存率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.50，如圖2B)，但TPX2 mRNA高表達(dá)組患者的無(wú)病生存率較低表達(dá)組患者顯著降低(P=0.017，圖2C)。

圖1 TPX2 mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

圖2 TPX2 mRNA的表達(dá)與腫瘤分期及患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 TPX2蛋白在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖3)顯示，在所有非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中，TPX2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為75%(45/60)，而在對(duì)應(yīng)的基底組織中，TPX2蛋白表達(dá)均為陰性，二者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 TPX2蛋白在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)情況

2.3 TPX2蛋白與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌臨床病理指標(biāo)和患者預(yù)后的聯(lián)系

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，本研究中膀胱癌組織中TPX2蛋白表達(dá)水平與腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、病理分級(jí)及術(shù)后是否復(fù)發(fā)等病理指標(biāo)有關(guān)(P＜0.05，表1)；Kaplan-Meier生存分析提示TPX2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的膀胱癌患者的術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間[(46.9±3.7)月]顯著短于陰性表達(dá)患者[(67.0±2.9)月](P＜0.05，圖4)。

表1 TPX2蛋白在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

圖4 TPX2蛋白表達(dá)與膀胱癌患者術(shù)后生存情況的關(guān)系

3 討論

在染色體水平，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在許多異倍體和多倍體，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的基因組變得極不穩(wěn)定，在一定程度上促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；而細(xì)胞內(nèi)異倍體的產(chǎn)生與細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程密切相關(guān)，眾所周知，有絲分裂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是DNA的復(fù)制和姐妹染色單體均等分裂到兩個(gè)子細(xì)胞中，在這一環(huán)節(jié)中，中心體和隨之形成的紡錘體發(fā)揮著重要作用[12-13]。近年來(lái)關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究也由細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等逐漸轉(zhuǎn)移到與有絲分裂相關(guān)的中心體及紡錘體上，這提示細(xì)胞有絲分裂中關(guān)鍵基因的表達(dá)可能成為腫瘤分子治療的新方向[14-15]。

TPX2在1997年被Heidebrecht等[7]首次發(fā)現(xiàn)，位于人染色體20q11.2，相對(duì)分子質(zhì)量100 k，它一方面通過(guò)與Xklp2蛋白質(zhì)結(jié)合使其附著在微管上從而引導(dǎo)中心體正確分向兩極；另一方面它與在有絲分裂以及細(xì)胞周期進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的Aurora A相互作用使其附著在微管上從而啟動(dòng)紡錘體的組裝；同時(shí)它可與Aurora A的結(jié)構(gòu)域結(jié)合使其發(fā)生磷酸化激活[7，16-17]。Li等[18]在通過(guò)對(duì)165例膀胱癌組織進(jìn)行基因共表達(dá)、功能富集及蛋白質(zhì)共表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)TPX2低表達(dá)的膀胱癌患者的總體生存率更高[18]。Jiang等[19]采用siRNA特異性敲低人宮頸癌細(xì)胞中TPX2的表達(dá)后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，且腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著下降[19]。Zou等[20]發(fā)現(xiàn)TPX2在膽管細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；此外，他們還發(fā)現(xiàn)敲低膽管癌細(xì)胞株中TPX2的表達(dá)后腫瘤細(xì)胞內(nèi)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白亦出現(xiàn)相應(yīng)變化[20]。TPX2在腫瘤中的這些作用充分說(shuō)明其潛在的探索價(jià)值，有可能成為新的腫瘤治療的理想分子靶點(diǎn)。

在本研究中，通過(guò)挖掘GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)及采用免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)TPX2 mRNA及蛋白在膀胱癌組織中均存在高表達(dá)，這與TPX2在其他腫瘤組織中的表達(dá)情況基本一致[19-20]。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示膀胱癌組織中TPX2蛋白的表達(dá)水平與腫瘤直徑、數(shù)目、病理分級(jí)及術(shù)后復(fù)發(fā)情況等顯著相關(guān)。雖然GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析提示TPX2 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)組患者之間總體生存率的差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TPX2 mRNA高表達(dá)組患者的無(wú)病生存率較低表達(dá)組患者明顯降低；此外，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組的膀胱癌患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間亦明顯縮短；這說(shuō)明膀胱癌組織中TPX2的表達(dá)水平升高可影響患者預(yù)后，由此我們認(rèn)為T(mén)PX2與膀胱癌進(jìn)展有關(guān)，有可能成為預(yù)測(cè)膀胱癌進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，TPX2在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平較高的患者預(yù)后較差。然而，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，所有病例基底組織中TPX2蛋白未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，這與TPX2在其他組織中的表達(dá)不一致，此外，多因素回歸分析提示TPX2高表達(dá)并不是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，我們推測(cè)，這可能與樣本誤差及我們定的陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)，接下來(lái)我們將繼續(xù)加大樣本量進(jìn)行分析；同時(shí)，我們還將通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證TPX2在膀胱癌進(jìn)展中的作用。