多巴脫羧酶對異色瓢蟲生殖力的調(diào)控機制

陳 旭, 田仁斌, 徐慶宣, 李 姝, 王 甦, 臧連生, 肖 達,*

(1.北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097;2.貴州大學, 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點實驗室, 貴陽 550025)

異色瓢蟲Harmoniaaxyridis屬于鞘翅目(Coleoptera)瓢蟲科(Coccinellinae)，是農(nóng)業(yè)和林業(yè)上一種重要的捕食性天敵昆蟲，對蚜蟲、葉螨、介殼蟲等重要害蟲具有很強的捕食能力(Koch，2003; 王甦等, 2007; 唐斌等, 2014)。異色瓢蟲也是典型的多型性物種，其成蟲鞘翅表型變化豐富，由黑色[黑底型(melanic)]或淡黃色[黃底型(succinic)]作為底色，鑲嵌以紅色或黑色圓點狀色塊(Bezzeridesetal., 2007)。據(jù)不完全統(tǒng)計，異色瓢蟲鞘翅色斑有200多種(Andoetal., 2018)。近年來，圍繞異色瓢蟲色型多樣性形成機制的研究逐漸增多，談家楨先生認為異色瓢蟲鞘翅表型的變異是黑色素與非黑色素(類胡蘿卜素衍生物)的分布范圍與布局的更動引起的，這與其鞘翅黑化過程中鞘翅內(nèi)部體液中的酶有相關(guān)性(庚鎮(zhèn)城和談家楨, 1980)；True(2003)研究認為異色瓢蟲鞘翅顏色的變異可能是昆蟲表皮的黑化現(xiàn)象；Chen等(2019)研究證明多巴胺黑色素是異色瓢蟲鞘翅黑色素的主要成分，且在實驗中發(fā)現(xiàn)干擾了編碼黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶——多巴脫羧酶(DOPA decarboxylase, DDC, EC 4.1.1.28)的基因表達后，異色瓢蟲雌蟲的生殖力明顯下降。但目前，多巴脫羧酶對于異色瓢蟲生殖的具體調(diào)控機制還未見報道。

多巴脫羧酶(DDC)是黑色素合成過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶(Hiruma and Riddiford, 2009)，除了參與昆蟲表皮的黑色素合成過程，還與昆蟲胚胎發(fā)育、幼蟲蛻皮、表皮骨化等有關(guān)(Arakaneetal., 2009; Wang Setal., 2013; Sterkeletal., 2019)。多巴脫羧酶主要存在于昆蟲的表皮、神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢細胞中(Wang MXetal., 2013)，催化多巴(dihydroxyphenylalanine, DOPA)生成多巴胺(dopamine, DA)，而多巴胺是生物體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與昆蟲的各種生命活動，它也是昆蟲生長發(fā)育過程中不可或缺的生物胺之一(Hodgetts and O′Keefe, 2006)。多巴胺可以參與調(diào)節(jié)昆蟲的求偶行為和生殖行為(姜宏健等, 2020)，還可以與其他生物胺和激素協(xié)同互作，調(diào)節(jié)社會性昆蟲的生殖行為及性別轉(zhuǎn)化(Haranoetal., 2005, 2008)。目前，多巴胺對于昆蟲生殖的調(diào)控機制在果蠅Drosophila中的研究較為透徹。多巴胺與蛻皮激素(molting hormone, MH)、保幼激素(juvenile hormone, JH)和章魚胺(octopamine, OA)之間的互作，不僅可以調(diào)節(jié)昆蟲的生殖行為，還可以調(diào)節(jié)卵細胞的發(fā)育(姜宏健等, 2020)。而這種互作的實現(xiàn)，通常依賴于調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)基因表達和酶的活性。

本實驗利用基因RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)對異色瓢蟲的多巴脫羧酶基因進行表達干擾，統(tǒng)計分析成蟲產(chǎn)卵量和子代卵的孵化率，并對卵巢進行解剖，對卵巢組織形態(tài)及卵巢管的發(fā)育進行研究。以期為闡明多巴脫羧酶對異色瓢蟲生殖力的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

異色瓢蟲為北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所室內(nèi)定殖種群。提供蠶豆蚜Aphiscurviness為食物對異色瓢蟲試驗種群進行擴繁。具體流程如下：種植蠶豆苗，對豆蚜進行擴繁，待豆蚜種群擴繁到適宜的密度時將其放入養(yǎng)蟲籠中，隨后接入異色瓢蟲的初孵幼蟲。放置于溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16L∶8D條件下飼養(yǎng)(Chenetal., 2019)。

1.2 試驗器材

冰箱、溫濕度計、透明養(yǎng)蟲盒(長×寬×高=13 cm×13 cm×8.0 cm)、培養(yǎng)皿(直徑：5.0 cm)、小型養(yǎng)蟲盒(直徑：6.0 cm，高：2.5 cm)、養(yǎng)蟲籠(長×寬×高=50 cm×45 cm×45 cm，尼龍網(wǎng)：120目)、玻璃研磨器(5 mL)、顯微注射系統(tǒng)Nanoject Ⅱ(World Presion Instruments)、MJ Research PTC-100 PCR儀(MJ Research Inc.)、Kodak電泳凝膠成像儀、高速冷凍離心機、Power/PAC 3000型電泳儀、NanoDrop One超微量紫外分光光度計等。

1.3 主要試劑

Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。cDNA合成試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit 切膠回收試劑盒和QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。MEGAscript?RNAi試劑盒為Ambion公司產(chǎn)品。氯仿、吖啶橙、1×PBS緩沖液、異丙醇、75%乙醇(用RNase-free水配制)均購自Sigma公司。

1.4 雙鏈RNA的合成

1.4.1引物設(shè)計：根據(jù)NCBI 中提供的異色瓢蟲多巴脫羧酶基因(HaDDC)(GenBank登錄號: KU820948)和綠色熒光蛋白基因(GFP)的序列信息，利用在線引物設(shè)計網(wǎng)站E-RNAi(http:∥www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php)設(shè)計引物。具體引物信息如表1所示。

表1 dsRNA合成所用引物序列

1.4.2總RNA提取與cDNA第1鏈的合成：將異色瓢蟲4齡幼蟲單頭放入玻璃勻漿器中，加入1 mL TRIzol試劑。室溫下放置5 min后，將其充分勻漿。按照Trizol試劑說明書提取總RNA，然后使用NanoDrop One分光光度計檢測RNA濃度和純度(ng/μL)。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，產(chǎn)物于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3含T7啟動子序列的雙鏈RNA(dsRNA)合成模板的制備：以異色瓢蟲cDNA為模板，利用含有T7啟動子序列的引物進行雙鏈RNA(dsRNA)模板的擴增。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 1 min; 94℃ 30 s, 70-60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 11個循環(huán); 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30個循環(huán); 72℃ 10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit試劑盒進行切膠回收目的片段產(chǎn)物，然后以回收產(chǎn)物為模板，繼續(xù)擴增目的片段，PCR反應(yīng)程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。確認目的條帶大小正確，無特異性擴增。采用QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行PCR產(chǎn)物的純化，NanoDrop One分光光度計進行濃度檢測。

1.4.4dsRNA的制備：根據(jù)MEGAscript?RNAi試劑盒的說明書，以1.4.3節(jié)所得的模板DNA為模板，在體外轉(zhuǎn)錄合成GFP和HaDDC的雙鏈RNA。利用NanoDrop One檢測dsRNA濃度，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 顯微注射

收集異色瓢蟲4齡幼蟲，將其放入玻璃培養(yǎng)皿中并加入滅菌水浸泡。10 min后取出幼蟲進行顯微注射dsGFP(對照組)和dsHaDDC(處理組)，注射量為300 ng/頭。注射部位為幼蟲背部倒數(shù)第1或第2個節(jié)間膜處。每個處理注射幼蟲40頭，3個生物學重復(fù)。已經(jīng)注射的幼蟲放入干凈的培養(yǎng)皿中，放置于標準的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)。

1.6 生殖力檢測

待幼蟲羽化為成蟲后，根據(jù)表型選取黑底四窗型異色瓢蟲成蟲進行交配，具體操作如下(圖1)：

圖1 HaDDC被RNAi后異色瓢蟲生殖力檢測

(1)注射dsGFP雄蟲×注射dsGFP雌蟲(G-M+G-F)；

(2)注射dsHaDDC雄蟲×注射dsHaDDC雌蟲(D-M+D-F)；

(3)注射dsGFP雄蟲×注射dsHaDDC雌蟲(G-M+D-F)；

(4)注射dsHaDDC雄蟲×注射dsGFP雌蟲(D-M+G-F)。

每個處理有3對瓢蟲，3個生物學重復(fù)。從羽化第8天后收集并開始記錄產(chǎn)卵量，統(tǒng)計20 d內(nèi)累計產(chǎn)卵量，產(chǎn)卵后第3天統(tǒng)計子代卵孵化率。

1.7 異色瓢蟲卵巢組織解剖與染色

待注射了dsHaDDC和dsGFP的4齡幼蟲羽化為成蟲后，按照雌雄1∶1的比例分別放入養(yǎng)蟲盒中，每個養(yǎng)蟲盒中共30頭成蟲。分別在羽化第8, 14 和20天時進行解剖。將異色瓢蟲雌成蟲放置于瓊脂糖凝膠培養(yǎng)皿中，腹部朝上并用標本針插入胸部第2節(jié)將其固定，隨后加入1×PBS緩沖液，用鑷子將腹部延中間小心剖開，分離卵巢組織，然后用1×PBS 緩沖液沖洗卵巢上的脂肪體。將沖洗完畢的卵巢放到新的載玻片上，然后加入一滴吖啶橙染料(0.02 mg/mL)，將其浸沒。將載玻片放入培養(yǎng)箱中，37℃避光染色15 min。染色結(jié)束后，將卵巢組織用1×PBS緩沖液沖洗2次，然后將沖洗完畢的卵巢組織放入新的載玻片上，加入1×PBS緩沖液。用熒光顯微鏡觀察卵巢的形態(tài)和卵巢管的發(fā)育情況，統(tǒng)計卵巢管數(shù)量并拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對各試驗所得觀測值進行統(tǒng)計分析，獲得平均值和標準誤。利用SigmaPlot進行作圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(SPSS V22)。

2 結(jié)果

2.1 抑制HaDDC表達對異色瓢蟲產(chǎn)卵量的影響

異色瓢蟲具有非常敏感的RNAi效應(yīng)(Xiaoetal., 2020)。將注射了dsGFP和dsHaDDC的4齡幼蟲在標準條件下飼養(yǎng)，成蟲羽化后第1天根據(jù)表型進行配對，第8天開始記錄產(chǎn)卵量，結(jié)果如圖2所示: 注射dsGFP雄蟲與注射dsGFP雌蟲(G-M+G-F)交配后，20 d內(nèi)累計產(chǎn)卵量達到371.33±84.31粒。相比之下，注射dsHaDDC雄蟲與注射dsHaDDC雌蟲(D-M+D-F)交配后，20 d內(nèi)累計產(chǎn)卵量僅為38.67±7.80粒，顯著低于對照組(P<0.05)。注射dsGFP雄蟲與注射dsHaDDC雌蟲(G-M+D-F)交配后，20 d內(nèi)累計產(chǎn)卵量為135.50±28.38粒，與對照組差異顯著(P<0.05)。注射dsHaDDC雄蟲與注射dsGFP雌蟲(D-M+G-F)交配后，20 d內(nèi)累計產(chǎn)卵量為76.00±14.00粒，與對照組差異顯著(P<0.05)。除此之外，我們在試驗過程中還觀察到對照組(G-M+G-F)所產(chǎn)的卵是聚集在一起的卵塊，而雌雄蟲均注射dsHaDDC的處理組(D-M+D-F)的卵，不聚集成卵塊，而是散落在實驗容器中。

圖2 RNAi介導(dǎo)的基因沉默抑制異色瓢蟲4齡幼蟲HaDDC表達對成蟲產(chǎn)卵量的影響

2.2 抑制HaDDC表達對異色瓢蟲子代卵孵化率的影響

對2.1節(jié)成蟲所產(chǎn)的卵3 d后統(tǒng)計記錄其孵化率，結(jié)果如圖3所示：對照組注射dsGFP雄蟲與注射dsGFP雌蟲(G-M+G-F)交配后, 子代卵孵化率達72.80%±1.38%；雌雄蟲均注射dsHaDDC(D-M+D-F)交配后，所產(chǎn)的卵均未孵化；注射dsGFP雄蟲與注射dsHaDDC雌蟲(G-M+D-F)交配后，子代卵孵化率為33.89%±2.38%，顯著低于對照組(P<0.05)；注射dsHaDDC雄蟲與注射dsGFP雌蟲(D-M+G-F)交配后, 子代卵孵化率僅為2.91%±0.56%，顯著低于對照組(P<0.05)。

圖3 RNAi介導(dǎo)的基因沉默抑制異色瓢蟲4齡幼蟲HaDDC的表達對子代卵孵化率的影響

2.3 抑制HaDDC表達對異色瓢蟲卵巢組織形態(tài)的影響

選取異色瓢蟲4齡幼蟲，分別注射dsGFP和dsHaDDC后放入養(yǎng)蟲室中飼養(yǎng)，在其羽化后第8天對雌成蟲卵巢進行解剖并拍照記錄。結(jié)果如圖4所示：注射dsHaDDC的雌成蟲卵巢形態(tài)和大小與注射dsGFP的對照組相比無明顯差異。

圖4 RNAi介導(dǎo)的基因沉默抑制異色瓢蟲4齡幼蟲HaDDC的表達對雌成蟲卵巢發(fā)育的影響

在上述同批的實驗試蟲中選取羽化后第8天的雌成蟲對其卵巢組織進行解剖，統(tǒng)計雙側(cè)卵巢中卵巢管的數(shù)量，結(jié)果如圖5所示：注射dsGFP的對照組雌成蟲卵巢管數(shù)量為63.95±9.22根，注射dsHaDDC的處理組雌成蟲卵巢管數(shù)量為59.19±9.65根，兩者無顯著差異(P>0.05)。

圖5 RNAi介導(dǎo)的基因沉默抑制異色瓢蟲4齡幼蟲HaDDC的表達對雌成蟲雙側(cè)卵巢管數(shù)量的影響

2.4 抑制HaDDC表達對異色瓢蟲卵發(fā)育的影響

異色瓢蟲在羽化后15 d左右開始產(chǎn)卵，我們選擇羽化后第14天雌成蟲對其卵巢進行解剖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：注射dsGFP的對照組雌成蟲卵巢形態(tài)飽滿，雙側(cè)卵巢管中均有卵母細胞發(fā)育，其中可見2粒成熟的卵粒(圖6: A)，除此之外，我們在解剖卵巢過程中還觀察到有散落的成熟卵粒；注射dsHaDDC的處理組雌成蟲卵巢形態(tài)也比較飽滿，雙側(cè)卵巢管中也有卵母細胞發(fā)育，但是未見已經(jīng)明顯成熟的卵粒(圖6: B)。

異色瓢蟲羽化后20 d左右進入產(chǎn)卵高峰期，我們選擇羽化后第20天雌成蟲對其卵巢進行解剖，結(jié)果表明：注射dsGFP的對照組雌成蟲卵巢形態(tài)飽滿，卵巢管中可見大量卵母細胞發(fā)育(圖6: C)；注射dsHaDDC的處理組雌成蟲卵巢形態(tài)較為飽滿，卵巢管中僅見少量卵母細胞發(fā)育(圖6: D)。

圖6 RNAi介導(dǎo)的基因沉默抑制異色瓢蟲4齡幼蟲HaDDC的表達對卵發(fā)育的影響

3 討論

昆蟲高效的繁殖能力不僅是害蟲暴發(fā)成災(zāi)的原因，也是益蟲人工飼養(yǎng)和利用的基礎(chǔ)。研究表明昆蟲的生殖能力主要受內(nèi)部因素如激素(郭郛, 1963)和生物胺(熊佳新等, 2019)等以及外部因素如營養(yǎng)(蘇天運, 1986)、溫度(蔣豐澤等, 2015)、濕度(周睿琦等, 2013)等的影響。生物胺是影響昆蟲生殖狀態(tài)的一種微量物質(zhì)，主要包括：多巴胺、酪胺、章魚胺、色胺和組胺(申王尚等, 2018)。多巴胺是昆蟲表皮鞣化過程的產(chǎn)物，由酪氨酸代謝而來，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase)和多巴脫羧酶是多巴胺合成過程中重要的限速酶。本研究以多巴脫羧酶為切入點，利用基因沉默技術(shù)從表觀遺傳學角度揭示其對異色瓢蟲生殖力的調(diào)控作用。

前期研究結(jié)果表明，異色瓢蟲具有非常敏感的基因沉默效應(yīng)。將多巴脫羧酶基因雙鏈RNA(dsHaDDC)注射到異色瓢蟲4齡幼蟲體內(nèi)，會引起其表達量顯著降低，同時出現(xiàn)明顯的黑色素缺失的表現(xiàn)型(Xiaoetal., 2020)。生殖力檢測結(jié)果表明，異色瓢蟲雌蟲的HaDDC基因被抑制表達后其產(chǎn)卵量顯著降低(圖2)。異色瓢蟲HaDDC基因被抑制表達后，其子代卵的孵化率也顯著降低(圖3)。在長紅獵蝽Rhodniusprolixus研究中同樣發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶抑制表達后，可以延遲產(chǎn)卵期并降低卵的孵化率(Sterkel and Oliveira, 2017; Sterkeletal., 2019)。綜上分析所述，我們可以推斷多巴脫羧酶可以調(diào)控異色瓢蟲的生殖力。目前對于多巴脫羧酶調(diào)控昆蟲生殖力的研究主要以其下游產(chǎn)物多巴胺為切入點進行(Sasaki and Nagao, 2001; Liuetal., 2008; 姜宏健等, 2020)。有研究表明多巴胺對于昆蟲生殖調(diào)控的機制是由其作為神經(jīng)遞質(zhì)對下游受體進行激活進而產(chǎn)生一系列與生殖相關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)(Gruntenko and Rauschenbach, 2008)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，多巴脫羧酶的下游產(chǎn)物多巴胺與昆蟲卵巢發(fā)育的關(guān)系十分密切，例如在螞蟻Diacammasp.和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中雌性個體腦內(nèi)多巴胺含量越高，其卵巢發(fā)育越好(Shimojietal., 2017)。我們研究中發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶被抑制表達后，異色瓢蟲的產(chǎn)卵量及其子代卵孵化率均顯著降低(圖2和3)。為探究產(chǎn)生這種影響的原因是否是由于多巴脫羧酶表達量降低導(dǎo)致了其產(chǎn)物多巴胺含量減少進而影響了異色瓢蟲卵巢的發(fā)育及功能，我們解剖了異色瓢蟲的卵巢組織，結(jié)果顯示HaDDC基因被抑制表達后不影響卵巢組織的形態(tài)發(fā)育(圖4: A, B)。有研究報道，瓢蟲卵巢管的數(shù)量與卵的數(shù)量密切相關(guān)(劉志偉等, 2016)，異色瓢蟲每側(cè)卵巢管數(shù)為28～33根(陳潔等, 2015)。我們又繼續(xù)探究了異色瓢蟲卵巢管的數(shù)量，研究發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶被抑制表達后卵巢管的數(shù)量降低，但與對照組無顯著差異(圖5)。因此，我們推斷多巴脫羧酶與異色瓢蟲卵巢管的發(fā)育進程無關(guān)，推測其可能參與了異色瓢蟲生殖過程的其他方面。綜上分析所述，多巴脫羧酶與異色瓢蟲卵巢發(fā)育無直接關(guān)系。

多巴脫羧酶產(chǎn)物多巴胺不僅影響昆蟲生殖系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生, 也影響昆蟲的交配行為。Neckameyer(1998)發(fā)現(xiàn)雄性果蠅體內(nèi)多巴胺含量降低所引起的同性求偶、交配紊亂。但本研究中，我們觀察發(fā)現(xiàn)異色瓢蟲多巴脫羧酶被抑制表達后，雌蟲和雄蟲之間可以正常交配。在黑須伊蚊Aedesatropalpus、雙斑蟋蟀Gryllusbimaculatus和黑腹果蠅D.melanogaster等昆蟲中研究發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶的產(chǎn)物多巴胺也能通過調(diào)控保幼激素作用于脂肪體，進而調(diào)節(jié)卵黃原蛋白的合成最終影響卵母細胞的發(fā)育(孫建新和譚璟憲, 1990; Woodring and Hoffmann, 1994; Gruntenko and Rauschenbach, 2008)。我們在異色瓢蟲產(chǎn)卵初期及產(chǎn)卵高峰期對其卵巢組織進行解剖，結(jié)果表明HaDDC基因被抑制表達后，卵巢組織中發(fā)育的卵母細胞個數(shù)及成熟的卵粒數(shù)均明顯少于對照組(圖6: B, D)。因此，我們推斷多巴脫羧酶可以調(diào)控異色瓢蟲卵母細胞到成熟卵粒的發(fā)育過程，進而參與對生殖力的調(diào)控。此外，有研究表明多巴脫羧酶參與卵殼表皮和絨毛膜硬化和變暗(Schlaeger and Fuchs, 1974)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)多巴脫羧酶被抑制表達后，子代卵的孵化率顯著降低，我們推斷可能是由于多巴脫羧酶被抑制表達后，影響卵殼的硬化過程，導(dǎo)致卵失水進而影響孵化。

綜上，本研究對異色瓢蟲多巴脫羧酶調(diào)控生殖力的機制進行解析，利用RNAi技術(shù)結(jié)合組織解剖證明多巴脫羧酶參與異色瓢蟲卵母細胞到成熟卵粒的發(fā)育過程，進而調(diào)控生殖力。本研究結(jié)果為利用RNAi機制為核心的害蟲防控技術(shù)提供備選基因。然而，對于多巴脫羧酶對異色瓢蟲卵母細胞發(fā)育的分子調(diào)控機制還有待進一步研究。