化瘀寧坤湯對(duì)盆腔炎大鼠TLR4/NFκB/COX2信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)的影響

李 穎，張霄峰，趙 敏，張 洋

（1.本溪市中醫(yī)院婦科，遼寧 本溪 117000；2.本溪市中醫(yī)院高醫(yī)門(mén)診，遼寧 本溪 117000；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 大連 116023）

盆腔炎屬女性生殖道感染疾病，可因炎癥輕重及范圍大小出現(xiàn)不同臨床癥狀，如下腹痛、發(fā)熱、陰道分泌物增加等癥狀，嚴(yán)重時(shí)影響生育，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。因此，尋找安全有效的治療方法對(duì)于盆腔炎治療極為重要。中藥化瘀寧坤湯可有效改善血液循環(huán)、促進(jìn)炎癥吸收和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，從而達(dá)到緩解疾病目的；在治療盆腔炎中具有一定療效，且已經(jīng)應(yīng)用于臨床[2]，但其作用機(jī)制尚不完全明確。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（nuclear kappa B，NF-κB）/環(huán)氧化酶2（cyxlooxygenase 2，COX2） 信號(hào)通路在炎癥免疫過(guò)程中起重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，TLR受體信號(hào)通路可調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)炎癥目的[3]。推測(cè)化瘀寧坤湯可能影響TLR4/NFκB/COX2信號(hào)通路從而實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎的保護(hù)。因此，機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜組織后混合菌液0.2 mL注入雙側(cè)子宮內(nèi)構(gòu)建盆腔炎大鼠模型，探討化瘀寧坤湯對(duì)盆腔炎大鼠子宮內(nèi)膜組織炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠、SPF級(jí)、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0014，體質(zhì)量（200±20）g，所有大鼠均在（12/12）h光照/黑暗、溫度（25±1）℃、濕度（50±5）%環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 藥品、試劑及儀器

化瘀寧坤湯：敗醬草20 g，三棱、莪術(shù)、赤芍、昆布各15 g，檳榔12 g，附子、桂枝各10 g，水蛭5 g。上述藥物均購(gòu)自張仲景大藥房，藥物制成1 g·mL-1生藥備用?；旌暇海ù竽c埃希菌:金黃色葡萄球菌:乙型溶血性鏈球菌2:1:1混合，混合菌液密度：生理鹽水制成每毫升3×109個(gè)），菌種均由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供。TLR4抑制劑Tak-242（上海蘭浚生物科技有限公司，貨號(hào)：GC16148）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-easine，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120）；大鼠白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，一抗兔抗 TLR4、NF-κB、COX2、GAPDH（美國(guó)abcam公司，貨號(hào)分別為：ab197742、ab208348、ab13556、ab28849、ab15191、ab181602）；免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）檢測(cè)試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆浱?hào)：96T）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司，型號(hào)：4600）。

1.3 模型制備及分組

實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余大鼠參考文獻(xiàn)[4]建立盆腔炎大鼠模型，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無(wú)菌條件下消毒，下腹正中切口0.8～1 cm，開(kāi)腹暴露出子宮，1 mL注射器機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜組織，之后混合菌液0.2 mL注入雙側(cè)子宮內(nèi)，逐層縫合切口。假手術(shù)組做相同處理，但不損傷子宮內(nèi)膜組織和注入混合菌液，其余步驟相同。造模15 d后給藥，化瘀寧坤湯組和化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組給予化瘀寧坤湯灌腸治療，根據(jù)大鼠和人給藥等效劑量，按體表面積折算劑量為6.25 mL[5]，灌腸前將藥物加熱至42 ℃左右，排空大小便，導(dǎo)尿管插入直腸灌藥，保留40 min以上，每日1次。TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組腹腔注射1 mg·kg-1Tak-242[6]，隔天1次，假手術(shù)組和模型組分別腹腔注射和灌腸等體積生理鹽水，20 d為1個(gè)療程。

1.4 子宮系數(shù)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 rpm/min離心10 min，收集上清置-80 ℃冰箱中保存。立即處死大鼠，觀察腹腔積液及子宮情況，取出子宮并稱量，部分子宮置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80 ℃冰箱中保存待檢。

根據(jù)子宮重量得子宮系數(shù)=子宮質(zhì)量÷體質(zhì)量。

1.5 HE檢測(cè)子宮組織形態(tài)

4%多聚甲醛中取出子宮組織，常規(guī)切片后HE染色觀察，四分位法病理評(píng)分：按照子宮粘連擴(kuò)張情況、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死及上皮細(xì)胞增生賦值0～3分。

1.6 ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平

嚴(yán)格按照大鼠IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α水平。

1.7 免疫濁度法檢測(cè)血清中Ig水平

免疫濁度法檢測(cè)血清中IgG、IgA和IgM水平。

1.8 蛋白免疫印跡檢測(cè)子宮組織中TLR4、NF-κB p65、COX2蛋白水平

取部分子宮組織，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白含量后上樣30 ug，SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，用一抗TLR4、NF-κB、COX2、GAPDH在4 ℃下孵育過(guò)夜，次日二抗孵育2 h，化學(xué)發(fā)光液顯色后，用Image-J軟件定量掃描蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=待測(cè)蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，比較行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化瘀寧坤湯對(duì)大鼠子宮系數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮系數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠子宮系數(shù)降低（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠子宮系數(shù)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠子宮系數(shù)比較（± s，n = 10） mg·g-1

表1 5組大鼠子宮系數(shù)比較（± s，n = 10） mg·g-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與化瘀寧坤湯組比較，▲P＜0.05；與TLR4抑制劑組比較，□P＜0.05

組別 子宮系數(shù)假手術(shù)組 2.19±0.43模型組 11.24±1.53#化瘀寧坤湯組 5.85±0.84△TLR4抑制劑組 7.47±0.92△化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組 3.57±0.25△▲□

2.2 化瘀寧坤湯對(duì)大鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（± s，n = 10） ng·mL-1

表2 5組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（± s，n = 10） ng·mL-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與化瘀寧坤湯組比較，▲P＜0.05；與TLR4抑制劑組比較，□P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α假手術(shù)組 7.14±0.86 4.86±0.85模型組 34.15±2.45# 20.88±1.87#化瘀寧坤湯組 14.85±1.52△ 13.41±1.14△TLR4抑制劑組 19.37±1.95△ 11.52±1.22△化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組 9.48±1.12△▲□ 6.48±0.74△▲□

2.3 化瘀寧坤湯對(duì)大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組血清中IgG、IgA水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠血清中IgG、IgA水平升高（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組大鼠血清中IgA水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 5組大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平比較（± s，n = 10） mg·mL-1

表3 5組大鼠血清中IgG、IgA和IgM水平比較（± s，n = 10） mg·mL-1

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與化瘀寧坤湯組比較，▲P＜0.05；與TLR4抑制劑組比較，□P＜0.05

組別 IgG IgA IgM假手術(shù)組 11.98±0.87 3.72±0.45 1.51±0.14模型組 8.47±0.73# 1.48±0.15# 1.47±0.41化瘀寧坤湯組 10.14±1.24△ 2.54±0.32△ 1.50±0.17 TLR4抑制劑組 9.85±0.91△ 2.16±0.27△ 1.48±0.46化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組 10.98±1.45△ 3.16±0.47△▲□1.49±0.38

2.4 化瘀寧坤湯對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜組織的影響

與假手術(shù)組相比，模型組子宮粘連擴(kuò)張、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮粘連擴(kuò)張、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分降低（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮粘連擴(kuò)張、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表4。

表4 5組大鼠子宮內(nèi)膜組織中病理評(píng)分比較（± s，n = 10） 分

表4 5組大鼠子宮內(nèi)膜組織中病理評(píng)分比較（± s，n = 10） 分

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與化瘀寧坤湯組比較，▲P＜0.05；與TLR4抑制劑組比較，□P＜0.05

組別 粘連或擴(kuò)張 慢性炎癥浸潤(rùn) 內(nèi)膜充血水腫 上皮變性壞死 上皮細(xì)胞增生假手術(shù)組 0.28±0.06 0.45±0.08 0.38±0.02 0.24±0.04 0.28±0.04模型組 2.52±0.48# 2.79±0.49# 2.04±0.41# 2.14±0.12# 2.47±0.35#化瘀寧坤湯組 1.34±0.35△ 1.84±0.42△ 1.25±0.34△ 1.47±0.42△ 1.57±0.28△TLR4抑制劑組 1.64±0.28△ 1.38±0.29△ 1.48±0.46△ 1.76±0.38△ 1.86±0.34△化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組 0.57±0.08△▲□ 0.87±0.21△▲□ 0.76±0.14△▲□ 0.87±0.14△▲□ 0.76±0.45△▲□

圖1 5組大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)變化（HE染色，×100）

2.5 化瘀寧坤湯對(duì)大鼠子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；分別與化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮組織中TLR4、COX2蛋白水平降低（P＜0.05）；與化瘀寧坤湯組相比，化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮組織中NF-κB蛋白水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表5。

表5 5組大鼠子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平比較（± s，n = 10）

表5 5組大鼠子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平比較（± s，n = 10）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與化瘀寧坤湯組比較，▲P＜0.05；與TLR4抑制劑組比較，□P＜0.05

組別 TLR4 NF-κB COX2假手術(shù)組 0.13±0.03 0.29±0.04 0.26±0.04模型組 0.42±0.05# 1.02±0.18# 0.73±0.11#化瘀寧坤湯組 0.26±0.03△ 0.43±0.08△ 0.45±0.05△TLR4抑制劑組 0.21±0.02△ 0.36±0.05△ 0.52±0.04△化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組 0.05±0.01△▲□ 0.25±0.03△▲ 0.23±0.03△▲□

圖2 5組大鼠子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平

3 討論

盆腔炎是目前臨床上難治疾病，西醫(yī)治療以抗生素為主，但易產(chǎn)生耐藥性和二重感染，不易長(zhǎng)期使用；中醫(yī)治療不僅副作用少，改善炎癥同時(shí)可增強(qiáng)免疫力，從而抵御微生物侵襲[7]。盆腔炎歸于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“少腹痛”“帶下病”“痛經(jīng)”“月經(jīng)不調(diào)”“不孕”“熱入血室”等范疇，因濕、熱、寒、癖蓄積胞宮胞絡(luò)、氣血不暢、日久癖血內(nèi)阻而發(fā)??；因此在治療上以清熱利濕、活血化瘀、消腫排膿等為主[8]?；鰧幚兴巍⒏阶泳鶠榫?，其中水蛭具有活血、化瘀、通絡(luò)之功效；附子具有溫經(jīng)散寒、助陽(yáng)扶正之功效[9]。三棱、莪術(shù)、赤芍、桂枝共為臣藥，其中三棱、莪術(shù)兩藥擅破血行氣、消積止痛；赤芍活血化瘀、消腫止痛；桂枝溫經(jīng)通陽(yáng)、溫陽(yáng)祛濕[10]。敗醬草、檳榔共為佐藥，其中敗醬草苦能燥濕，有活血化瘀止痛之功效；檳榔行下焦之氣、俾氣行則血行[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮系數(shù)，子宮粘連擴(kuò)張、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分升高；與模型組相比，化瘀寧坤湯組大鼠子宮系數(shù)，子宮粘連擴(kuò)張、慢性炎癥浸潤(rùn)、內(nèi)膜充血水腫、上皮變性壞死、上皮細(xì)胞增生病理評(píng)分降低。提示盆腔炎大鼠子宮出現(xiàn)粘連擴(kuò)張、炎癥、充血水腫、上皮壞死、上皮增生等多種病理現(xiàn)象，導(dǎo)致子宮腫脹、體積變大，子宮系數(shù)增大，子宮損傷嚴(yán)重。經(jīng)化瘀寧坤湯治療后，子宮粘連擴(kuò)張、炎癥、水腫、上皮壞死、細(xì)胞增生等現(xiàn)象得以緩解，逐漸恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎子宮的保護(hù)。

IL-1β、TNF-α均為炎癥因子，均可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其中IL-1β是由巨噬細(xì)胞分泌的重要炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)促炎因子在內(nèi)皮細(xì)胞聚集從而參與盆腔炎炎癥反應(yīng)[12]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的最早階段，能夠激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)其他炎癥因子的釋放[13]。Ig屬機(jī)體抗感染的重要屏障，可在補(bǔ)體協(xié)同作用下殺死或溶解病原微生物，屬機(jī)體抗感染免疫中重要防御機(jī)制。IgG、IgA和IgM均作為Ig，發(fā)揮體液免疫作用，其中IgG更易透過(guò)毛細(xì)血管壁，從而發(fā)揮抗感染、抗毒素和調(diào)理功效；IgA具有抗菌、抗病毒、抗毒素作用；IgM可參與腫瘤細(xì)胞破壞作用，屬高能效抗體[14]。盆腔炎中免疫功能發(fā)生障礙影響機(jī)體功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組血清中IL-1β、TNF-α水平升高，IgG、IgA水平降低；與模型組相比，化瘀寧坤湯組血清中IL-1β、TNF-α水平降低，IgG、IgA水平升高。提示盆腔炎中炎癥現(xiàn)象明顯，免疫功能下降，機(jī)體更易感染病毒、細(xì)菌、毒素等，導(dǎo)致加重機(jī)體病情。化瘀寧坤湯治療后促進(jìn)炎癥吸收和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能從而緩解疾病進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎的保護(hù)。

TLR4/NFκB/COX2信號(hào)通路在炎癥和免疫信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，TLR4作為重要免疫炎癥調(diào)控因子，可啟動(dòng)機(jī)體炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞中[15]；NFκB作為重要核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[16]；COX2屬膜結(jié)合蛋白，是合成前列腺素和血栓素的關(guān)鍵蛋白，是花生四烯酸代謝過(guò)程中關(guān)鍵限速酶，廣泛存在于機(jī)體免疫、炎癥過(guò)程中[17]。TLR4被生物配體識(shí)別并結(jié)合后可促進(jìn)下游NFκB活化，從而促進(jìn)下游多種促炎因子（如IL-1β、TNF-α）等釋放，促進(jìn)機(jī)體損傷[18-19]；同時(shí)NFκB可調(diào)控下游炎癥蛋白COX2表達(dá)，COX2亦可由IL-1β、TNF-α誘導(dǎo)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平升高，提示盆腔炎大鼠子宮組織中TLR4/NFκB/COX2信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，TLR4激活機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)，促進(jìn)NFκB活化，從而促進(jìn)炎癥蛋白COX2表達(dá)、促炎因子IL-1β、TNF-α等釋放，加重疾病進(jìn)程。與模型組相比，化瘀寧坤湯組、TLR4抑制劑組、化瘀寧坤湯+TLR4抑制劑組子宮組織中TLR4、NF-κB、COX2蛋白水平降低，提示化瘀寧坤湯與TLR4抑制劑功能類似，均可抑制TLR4活化，使NFκB活化降低，從而使促炎蛋白、促炎因子水平降低，減少炎癥水平，同時(shí)提高免疫力，實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎的保護(hù)。

綜上所述，化瘀寧坤湯可抑制TLR4/NFκB/COX2信號(hào)通路從而降低盆腔炎大鼠子宮內(nèi)膜組織的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎的保護(hù)。但化瘀寧坤湯成分復(fù)雜，亦可能通過(guò)別的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)盆腔炎的保護(hù)，有待進(jìn)一步研究。