禽源煙曲霉菌和黃曲霉菌的分離鑒定及幾種中藥抑菌作用研究

薛文慧，趙千惠，梁 天，王明迪，孫 鵬，霍書英，李 永

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071001；2.河北定農(nóng)農(nóng)業(yè)科技集團(tuán)股份有限公司，保定 073000)

霉菌污染一直是全球關(guān)注的問題，特別是在動物的養(yǎng)殖環(huán)境及飼料加工、運(yùn)輸和儲存過程中的霉菌污染，霉菌及霉菌代謝產(chǎn)生的毒素對人和動物的健康造成極大的危害[1-2]。霉菌在自然界中普遍存在，其中煙曲霉菌和黃曲霉菌是最常見的致病菌，易引起人類和動物急性或慢性呼吸道疾病，造成肺損傷，被稱為曲霉肺炎[3]。每年有大量家禽因墊料和飼料霉變而感染黃曲霉菌和煙曲霉菌，引發(fā)中毒死亡[4]。霉菌飼料產(chǎn)生的霉菌毒素影響家禽生產(chǎn)性能，同時引起家禽免疫功能下降等各種疾病，最終通過家禽產(chǎn)品危害人類健康[5]。

目前，臨床用于抗煙曲霉菌、黃曲霉菌的藥物有唑類、多烯類、脂質(zhì)體類、棘白素類等。其中唑類包括伏立康唑和伊曲康唑，多烯類包括兩性霉素B等。這些抗菌藥物不僅價格昂貴，還易產(chǎn)生耐藥性[6]。為保障動物健康和人類的安全，尋找安全、具有抗菌活性的天然藥物已成為研究熱點(diǎn)。石菖蒲[7](Acorusgramineus)、決明子[8](Cassiaobtusifolia)、黃柏[9](Phellodendronchinensis)、苦參[10](Sophoraflavescens)、辣蓼[11](Polygonumhydropiper)、白頭翁(Pulsatillaadans)、蒲公英[12](Herbataraxaci)均具有清熱祛濕、抗蟲消炎和抑菌等藥理作用，Zhang等[13]前期研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲和辣蓼對光滑念珠菌的生長有明顯的抑制作用，故本試驗針對禽源煙曲霉菌和黃曲霉菌探究中草藥石菖蒲、決明子、黃柏、苦參、白頭翁、辣蓼、蒲公英的抑菌作用，以期為禽類抗霉菌天然藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 河北省保定市農(nóng)翔畜禽診所臨床病鴨，病鴨精神不振，羽毛蓬松，排淡綠色稀便，站立不穩(wěn)，剖檢肺部有灰白色結(jié)節(jié)，取其病變肺臟組織分離病原菌。

1.1.2 試驗動物 20只2周齡的SPF雞由河北省保定市定農(nóng)集團(tuán)提供。

1.1.3 主要試劑及儀器 葡糖糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Taq酶、TaqBuffer、dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司；Omega真菌DNA提取試劑盒購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；石菖蒲、黃柏、決明子、苦參、白頭翁、辣蓼、蒲公英均購自安國藥材市場。DNP-9082培養(yǎng)箱購自上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；超聲提取儀購自上海育模儀器有限公司；SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵購自河南省予華儀器有限公司；Bio-Rad酶標(biāo)儀購自北京線上生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與形態(tài)觀察 臨床剖檢送檢病鴨,發(fā)現(xiàn)米粒大小的灰白色結(jié)節(jié)覆蓋在肺臟表面，肝臟發(fā)黃、腫大呈豆腐渣狀。采集肺部結(jié)節(jié)混于無菌生理鹽水中，取100 μL 均勻涂抹于SDA培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)42 h后觀察，挑取單菌落于載玻片上進(jìn)行顯微鏡觀察，并運(yùn)用劃線法將單菌落進(jìn)行分離純化。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 用真菌DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)48 h時SDA培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物DNA。鑒定真菌通用引物序列為：ITS1：5′-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCG-CTTATTATTGATATGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為560 bp。PCR反應(yīng)體系50 μL：10×ExTaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL，上、下引物各2 μL，5 U/μL ExTaq0.5 μL，DNA模板2 μL，DEPC水34.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司測序，比對測序結(jié)果，并利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 動物回歸試驗 將20只雛雞隨機(jī)分為對照組和試驗組，每組10只，連續(xù)7 d給試驗組雛雞鼻腔涂抹分離的病原菌后剖檢，對照組雛雞不作任何處理，正常飼喂，剖檢后觀察臟器是否發(fā)生病變及病變部位是否長出類似病鴨肺部的灰白色結(jié)節(jié)，并對病變部位做病理切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.2.4 中藥提取 參考Zhang等[14]方法，將中藥石菖蒲、黃柏、決明子、苦參、白頭翁、辣蓼和蒲公英粉碎后分別稱取100 g，用60%乙醇按料液比1∶10的比例浸泡24 h， 30 ℃超聲提取3次，每次15 min,藥液減壓抽濾2次，濾液3 000 r/min離心10 min，取上清于80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至2 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 最小抑菌濃度MIC80測定 依據(jù)CLSI編訂的M27-E4標(biāo)準(zhǔn)測定各中藥MIC80，使用改良微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗。取2 g/mL藥液混于SDA液體培養(yǎng)基中，運(yùn)用倍比稀釋法將濃度依次稀釋為1 024、512、256、128、64、32、16和8 μg/μL，取100 μL于無菌96孔板內(nèi)，每個濃度3個重復(fù)。用SDA液體培養(yǎng)基將菌液稀釋為103CFU/mL，取100 μL于中藥孔中使中藥終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8和4 μg/μL，取100 μL菌液和100 μL培養(yǎng)基做陽性對照，取200 μg/μL培養(yǎng)基做陰性對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定D630 nm值，試驗重復(fù)3次。

1.2.6 體外藥敏試驗 取2 g/mL中藥液混于SDA瓊脂培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中中藥濃度分別為256、128、64、32和16 μg/μL，無菌生理鹽水制備10 CFU/mL菌液，均勻涂抹于培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24、48和72 h，記錄菌落數(shù)量，測定菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有試驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌形態(tài)觀察結(jié)果

在SDA培養(yǎng)基中分離純化后發(fā)現(xiàn)2種形態(tài)不同的病原菌，暫稱為菌落1和菌落2。菌落1培養(yǎng)12 h呈白色，24 h中心呈亮黃色，48 h變?yōu)辄S綠色呈棉花狀，菌絲分散，菌核大小為10 mm(圖1A)。培養(yǎng)12 h時菌落2呈白色，24 h呈綠色，48 h呈灰綠色，菌絲呈分散蓬松絨毛狀，菌核大小為14 mm(圖1B)。40倍顯微鏡下菌落1孢子頭部呈球形，頂部雙層呈放射性排列(圖1C)；菌落2孢子呈球形，頂部呈瓶狀，周圍布滿綠色小刺(圖1D)。

A，培養(yǎng)48 h時菌落1形態(tài)；B，培養(yǎng)48 h時菌落2形態(tài)；C，菌落1的分生孢子(40×)；D，菌落2的分生孢子(40×)A,Morphology of colony 1 at 48 h;B,Morphology of colony 2 at 48 h;C,Conidia of colony 1 (40×);D,Conidia of colony 2 (40×)圖1 病原真菌形態(tài)Fig.1 Morphology of pathogenic fungi

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 目的基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增片段大小約為560 bp(圖2)，與預(yù)期大小相符。

M，DL2000 DNA Marker；1，菌落1；2，菌落2M，DL2000 DNA Marker；1,Colony 1;2,Colony 2圖2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of target gene

2.2.2 菌株1系統(tǒng)進(jìn)化樹 在BLAST中比對選取黃曲霉菌MK108310、MK002477238、MK002477242、MK002477244、MK002477247、MK002477237、MK002477240、MK002477245和MK002477250，以及大衛(wèi)氏菌屬(Davidiellasp.) MK108394與菌株1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，黃曲霉菌MK108310與菌株1的親緣關(guān)系最近，相似性高達(dá)99.82%，判定菌株1屬于黃曲霉菌屬(圖3)。

圖3 菌株1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 1

2.2.3 菌株2系統(tǒng)進(jìn)化樹 經(jīng)BLAST比對選取煙曲霉菌KY926853、NC_007201、NC_007195、NC_007196、NC_00719、NC_007200、NC_007198、NC_007196、NC_007197、NC_007194與菌株2進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，其中NC_007201與菌株2親緣關(guān)系最近，判定菌株2為煙曲霉菌屬(圖4)。

圖4 菌株2系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 2

2.3 動物回歸試驗結(jié)果

動物回歸試驗結(jié)束后對照組雛雞反應(yīng)靈敏，叫聲洪亮，食欲旺盛，而試驗組雛雞呼吸困難，精神不振，站立不穩(wěn)，羽毛蓬松，閉目嗜睡。剖檢發(fā)現(xiàn)試驗組雛雞肝臟出現(xiàn)類似病鴨肺部灰白色結(jié)節(jié)，肝臟呈黃色，質(zhì)地易碎呈豆腐渣樣，肺臟腫大呈紫紅色；組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟病變部位出現(xiàn)肉芽腫病變(圖5B)，在SDA培養(yǎng)基中將白色結(jié)節(jié)分離純化后長出煙曲霉菌和黃曲霉菌。

A,對照組；B，試驗組A,Control group; B,Test group圖5 肝臟組織病理學(xué)觀察(20×)Fig.5 Histopathological observation of liver (20×)

2.4 MIC80測定結(jié)果

7種中藥MIC80測定結(jié)果見表1，當(dāng)石菖蒲MIC80≥8 μg/μL、黃柏MIC80≥16 μg/μL、決明子MIC80≥32 μg/μL、苦參MIC80≥64 μg/μL時測得煙曲霉菌的D630 nm值與陰性對照相比下降了80%以上，當(dāng)石菖蒲MIC80≥8 μg/μL、決明子MIC80≥16 μg/μL、黃柏MIC80≥32 μg/μL、苦參和辣蓼MIC80≥64 μg/μL時測得黃曲霉菌的D630 nm0值與陰性對照相比下降了80%以上，而白頭翁和蒲公英MIC80≥128 μg/μL，可見石菖蒲、黃柏和決明子對煙曲霉菌和黃曲霉菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，而苦參、辣蓼、白頭翁和蒲公英對其生長無顯著抑制作用。

表1 中藥MIC80測定結(jié)果

2.5 煙曲霉菌藥敏試驗結(jié)果

由表2和圖6、7可知，中藥液濃度為128 μg/μL的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，石菖蒲和黃柏中無菌落長出，決明子中長出25.5個菌落,直徑為4 mm；而苦參長出28.5個菌落，直徑為5 mm，辣蓼長出21.0個菌落，直徑為9 mm；白頭翁長出24.5個菌落，直徑為17 mm；蒲公英長出16.5個菌落,直徑為18 mm。培養(yǎng)基中石菖蒲濃度為16 μg/μL時長出20.0個菌落，黃柏濃度為32 μg/μL時長出34.0個菌落?？梢娛牌褜熐咕纳L具有較強(qiáng)的抑制作用，其次是黃柏和決明子的抑制作用顯著。

表2 不同中藥濃度培養(yǎng)基中煙曲霉菌的生長情況

A,空白；B，蒲公英；C，辣蓼；D,白頭翁；E,苦參；F,決明子；G,黃柏；H,石菖蒲A,Blank;B,Herba taraxaci;C,Polyonum hydropiper;D,Pulsatilla adans;E,Sophora flavescens;F,Cassia obtusifolia;G,Phellodendron chinensis;H,Acorus gramineus圖6 煙曲霉菌在濃度為128 μg/μL的中藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的生長狀態(tài)Fig.6 Growth status of Aspergillus fumigatus cultured in traditional Chinese medicine medium with a concentration of 128 μg/μL for 72 h

圖7 煙曲霉菌在濃度為128 μg/μL的中藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的菌落直徑Fig.7 Colony diameter of Aspergillus fumigatus cultured in traditional Chinese medicine medium with a concentration of 128 μg/μL for 72 h

2.6 黃曲霉菌藥敏試驗結(jié)果

由表3和圖8、9可知，中藥濃度為128 μg/μL的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，石菖蒲和決明子中無菌落長出，黃柏中長出34.5個菌落，直徑為2 mm；而苦參長出41.5個菌落，直徑為7 mm，辣蓼長出40.0個菌落，直徑為6 mm；白頭翁長出44.5個菌落，直徑為9 mm；蒲公英長出37.5個菌落,直徑為16 mm。培養(yǎng)基中石菖蒲濃度為16 μg/μL時長出34個菌落，決明子濃度為32μg/μL時長出31.5個菌落。可見石菖蒲、決明子和黃柏對黃曲霉菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，其中石菖蒲的抑制作用最為顯著。

表3 不同中藥濃度培養(yǎng)基中黃曲霉菌的生長情況

A，空白；B，蒲公英；C，白頭翁；D，苦參；E，辣蓼；F，黃柏；G，決明子；H，石菖蒲A,Blank;B,Herba taraxaci;C,Pulsatilla adans;D,Sophora flavescens;E,Polyonum hydropiper;F,Phellodendron chinensis;G,Cassia obtusifolia;H,Acorus gramineus圖8 黃曲霉菌在濃度為128 μg/μL的中藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的生長狀態(tài)Fig.8 Growth status of Aspergillus flavus cultured in traditional Chinese medicine medium with a concentration of 128 μg/μL for 72 h

圖9 黃曲霉菌在濃度為128 μg/μL的中藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h的菌落直徑Fig.9 Colony diameter of Aspergillus flavus cultured in traditional Chinese medicine medium with a concentration of 128 μg/μL for 72 h

3 討 論

家禽生產(chǎn)受到多種真菌病的影響，包括曲霉菌病、念珠菌病、黃霉病、毛霉菌病、組織胞漿菌病和隱球菌病，在這些真菌疾病中，曲霉菌病和念珠菌病最為突出。曲霉病是由煙曲霉菌和黃曲霉菌引起的真菌感染，也是重要的空氣傳播腐生真菌[15]。臨床上經(jīng)常使用唑類和抗生素類抗真菌藥物治療曲霉菌感染，但隨著上述藥物長期的推廣應(yīng)用，不僅有副作用且易使機(jī)體易產(chǎn)生耐藥性[16]，故尋找天然無殘留抗真菌藥物具有重要意義。本試驗從臨床病鴨肺部分離出2種不同形態(tài)的霉菌，通過形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其菌落顏色形態(tài)與黃曲霉菌和煙曲霉菌菌落形態(tài)類似，經(jīng)ITS分子鑒定和相似性比對，確定2種病原菌為黃曲霉菌屬和煙曲霉菌屬，采用ITS片段鑒定真菌是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)有效的方法。ITS保守型在種內(nèi)相對一致，不同種間差異明顯，可反映種間甚至菌株之間的差異[17]。在顯微鏡下觀察煙曲霉菌和黃曲霉菌菌絲，可觀察到成熟分生孢子?，F(xiàn)有研究表明，黃曲霉菌絲的分生孢子為兩層小梗，煙曲霉菌絲的分生孢子為單層小梗[18-19]。此外，黃曲霉菌和煙曲霉菌通過分生孢子啟動高度極化的生長過程，導(dǎo)致機(jī)體侵襲性感染[20]，尤其1～3周齡雛鴨對霉菌極為敏感，常為群發(fā)，死亡率極高[21]。

在家禽養(yǎng)殖行業(yè)霉菌污染一直是難以避免的問題，黃曲霉菌和煙曲霉菌對不同階段動物的致病性不同，雛鴨極為敏感，而養(yǎng)殖業(yè)中雞的養(yǎng)殖比重遠(yuǎn)超過鴨，且黃曲霉菌和煙曲霉菌是經(jīng)呼吸系統(tǒng)感染的急性或慢性疾病，可造成全身性感染[22]，故本試驗經(jīng)鼻腔涂抹病原菌使雛雞感染，探究從病鴨肺部分離的黃曲霉菌和煙曲霉菌對雛雞是否具有致病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雛雞出現(xiàn)明顯類似病鴨的癥狀，食欲減退，精神不佳，站立不穩(wěn)，肝臟和肺臟出現(xiàn)病變，鏡檢可見病變部位有明顯的肉芽腫病變。肉芽腫是由于各種病原體感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤所致，是霉菌感染的典型癥狀[23]，由此可見從病鴨肺部分離出的黃曲霉菌和煙曲霉菌對雛雞也具有致病性。超聲提取技術(shù)是近年來提取中藥有效成分的新工藝之一，可瞬時破壞藥材細(xì)胞壁，增強(qiáng)溶劑滲透至細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而增強(qiáng)中藥活性成分在溶劑中的溶出，可提高提取率、節(jié)省藥材與溶劑、縮短提取時間，適用于絕大多數(shù)中藥有效成分的提取[24]，中藥的有效成分為有機(jī)物，易溶于乙醇[25]，因此，本研究采用超聲波乙醇提取法粗提中藥液，對黃曲霉菌和煙曲霉菌進(jìn)行體外藥敏試驗。

中藥毒性小，不易產(chǎn)生耐藥性，多種活性成分共同發(fā)揮作用[26]。培養(yǎng)基體外藥敏試驗可直觀探究中藥液對黃曲霉菌和煙曲霉菌生長的抑制作用。黃曲霉菌和煙曲霉菌在SDA培養(yǎng)基中生長最快，故選用SDA培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗。直至石菖蒲濃度降為16 μg/μL時，培養(yǎng)基才長出黃曲霉和煙曲霉菌落，決明子濃度降為32 μg/μL時才長出黃曲霉菌菌落，黃柏濃度降為32 μg/μL時才長出煙曲霉菌菌落，可見石菖蒲對黃曲霉菌和煙曲霉菌的抑制作用最強(qiáng)。石菖蒲中揮發(fā)油活性成分α-細(xì)辛酮和阿卡塔酮C協(xié)同抗真菌，對白色念珠菌也具有較強(qiáng)的抑制作用[27]，且對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母菌、大腸埃希菌和痢疾桿菌也具有抑制作用[28]，石菖蒲對黃曲霉菌和煙曲霉菌的抑制作用是否是揮發(fā)油活性成分發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。黃柏和決明子對煙曲霉菌和黃曲霉菌的抑制作用較為顯著。研究顯示，黃柏中的生物堿具有一定的抑菌作用，其中小檗堿可在一定程度上減少菌群[29]，決明子對植物病原菌也具有抑制作用[30]。而在苦參、辣蓼、白頭翁和蒲公英濃度為128 μg/μL的培養(yǎng)基中就已長出黃曲霉菌和煙曲霉菌的菌落，因此，苦參、辣蓼、白頭翁和蒲公英對黃曲霉菌和煙曲霉菌的抑制作用不顯著。 研究顯示，苦參對白色念珠菌等有抑制作用[31]，辣蓼對致病性大腸桿菌等有抑制作用[32]，白頭翁對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等有抑制作用[33]，蒲公英對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌等有抑制作用[34]。綜上，石菖蒲、黃柏和決明子對黃曲霉菌和煙曲霉菌有顯著的抑制作用，其中石菖蒲的抑制性最為顯著，而3種中藥的抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

石菖蒲、黃柏和決明子對禽源煙曲霉菌和黃曲霉菌有較強(qiáng)的抑制作用，其中石菖蒲的抑制作用最強(qiáng)，而苦參、辣蓼、白頭翁、蒲公英對禽源煙曲霉菌和黃曲霉菌無明顯抑制作用，本試驗為動物健康和食品抗真菌藥物的生產(chǎn)提供了新思路。