熱量限制對(duì)腎缺血損傷后纖維化的影響及機(jī)制研究

查宏楚 朱杰夫 師 朗 夏 瑤 李惠敏 宋志霞

急性腎損傷(AKI)是較為常見(jiàn)的嚴(yán)重臨床綜合征,其主要臨床特征是腎功能在短期內(nèi)下降導(dǎo)致體內(nèi)肌酐和尿素等含氮廢物蓄積。據(jù)統(tǒng)計(jì),AKI每年造成約200萬(wàn)人死亡,且部分存活的AKI患者仍可進(jìn)展為慢性腎臟病(CKD)[1-4]。多種CKD均以腎纖維化為共同終點(diǎn)且難以逆轉(zhuǎn)。腎纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)度沉積導(dǎo)致組織瘢痕為特征,其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確,目前臨床上無(wú)有效防治措施。

熱量限制(CR)預(yù)處理對(duì)腎損傷的保護(hù)作用在多種嚙齒類(lèi)動(dòng)物損傷模型中得以證實(shí)[5-7]。近期來(lái)自科隆大學(xué)的Roman-Ulrich Müller團(tuán)隊(duì)在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)模型,探討了CR對(duì)腎損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制[8]。但是在臨床實(shí)踐中多面臨的是腎臟缺血的后期階段,而CR在腎臟缺血后修復(fù)中的作用及機(jī)制尚不清楚。本文擬探討CR對(duì)腎臟IRI后纖維化的影響及機(jī)制。

對(duì)象與方法

研究對(duì)象C57BL/6J小鼠購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。腎小管特異性ATG7基因敲除(RT-Atg7-KO)鼠是通過(guò)ATG7 flox/flox小鼠同KSP3.1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交培育建立的RT-Atg7-KO小鼠模型(圖1)。ATG7 flox/flox和KSP3.1-Cre小鼠購(gòu)自美國(guó)緬因州Jackson實(shí)驗(yàn)室。自噬報(bào)告小鼠為RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)基因鼠[C57BL/6-Tg(CAG/RFP/EGFP/Map1LC3B)1Hill/J],購(gòu)自美國(guó)緬因州Jackson實(shí)驗(yàn)室。

圖1 A：腎小管特異性ATG7基因敲除鼠的鑒定及驗(yàn)證;B：ATG7免疫印跡代表圖

實(shí)驗(yàn)方法

分組和造模 本動(dòng)物研究方案經(jīng)三峽大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)202205010T2)。將體重為20～25 g的C57BL/6J雄性小鼠(共20只)隨機(jī)分為假手術(shù)組、假手術(shù)CR組、IRI組(左側(cè)腎臟缺血30 min再灌注)、IRI-CR組(左側(cè)缺血30 min再灌注CR),每組5只鼠。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法,術(shù)前麻醉小鼠,分離左側(cè)腎動(dòng)脈,用動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈30 min,后松開(kāi)動(dòng)脈夾,將小鼠肌層和皮膚層依次縫合[9]。整個(gè)手術(shù)過(guò)程小鼠體溫維持在(36 ℃～37.2 ℃)。術(shù)后第3天開(kāi)始,CR組小鼠限時(shí)喂食(進(jìn)食時(shí)間3.5 h),每日飲食攝入量為正常水平的 66%,對(duì)照組小鼠缺血術(shù)后自由飲食,所有動(dòng)物均自由飲水。每天限時(shí)飲食時(shí)觀察各組小鼠狀態(tài)情況并記錄。在再灌注第20天行右腎切除術(shù),右腎切除術(shù)后24 h麻醉小鼠并通過(guò)左側(cè)腎動(dòng)脈取血,留取血清樣本采用7 600 p Hitachi生化儀器檢測(cè)血清肌酐、尿素氮。同時(shí)左側(cè)腎臟做冠狀切面,留取部分組織行病理檢查(圖2A)。RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報(bào)告小鼠、RT-Atg7-KO鼠的造模方法與C57BL/6J雄性小鼠一致。

免疫組化和腎小管損傷評(píng)分 經(jīng)多聚甲醛固定后的腎組織分別經(jīng)過(guò)梯度乙醇70%、85%、95%、100%脫水以及二甲苯處理后進(jìn)行石蠟包埋。5 μm的石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯和乙醇的逐步水化后進(jìn)行免疫組化、Masson及HE染色,染色腎組織石蠟切片脫蠟后水洗,檸檬酸抗原修復(fù),封閉。Beclin1一抗(proteintech,11306-1-AP,1∶200)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗(RnDSystems, MAB1420-SP,1∶20)。

腎小管損傷評(píng)分:視野內(nèi)有0～25%損傷小管為1分,視野內(nèi)有26%～50%損傷小管為2分,視野內(nèi)有51%～75%損傷小管為3分,視野內(nèi)有>75%損傷小管為4分。 所有的切片為隨機(jī)檢查外髓質(zhì)和皮質(zhì)部分,每張切片檢測(cè)10個(gè)視野,取平均值計(jì)算腎小管損傷評(píng)分,用顯微鏡拍攝具有代表性的照片。

免疫印跡 SDS蛋白裂解液提取各組腎皮質(zhì)組織蛋白,檢測(cè)ATG7(Proteintech,10088-2-AP,1∶1 000)、β-actin(ZEN BIO,380624,1∶5 000)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)(Novusbio,NB100-2220,1∶1 000)的表達(dá)。稀釋后的一抗4℃孵育過(guò)夜,洗滌后辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光對(duì)印跡進(jìn)行檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《Graph Pad Prism 9.0.0》進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)確定兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析確定兩組以上之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CR加重了腎缺血性纖維化結(jié)果顯示,IRI后采用CR處理組血清肌酐(圖2B)和尿素氮(圖2C)較正常飲食組顯著升高。腎組織HE染色可見(jiàn)IRI后腎間質(zhì)炎性浸潤(rùn)、小管擴(kuò)張、間質(zhì)增生等損傷,其中CR處理組明顯加重(圖3A)、腎小管損傷評(píng)分CR組較高(圖3B)。最值得關(guān)注的是,相比于單純IRI組,CR組細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積導(dǎo)致組織瘢痕異常明顯,包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肌成纖維細(xì)胞活化、小管萎縮和毛細(xì)血管稀疏化等(圖4A)。纖維化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)和纖維化面積比也在CR處理組明顯增加(圖4B、C)。

圖2 實(shí)驗(yàn)流程及C57BL/6J小鼠腎功能Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖;B:各組血清肌酐結(jié)果;C:各組尿素氮結(jié)果;*:與Sham 或者 Sham+CR組相比,P<0.05;#:與UI30R組相比,P<0.05;n=5

圖3 C57BL/6J小鼠腎臟組織HE染色及腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:腎組織HE染色(×400);B:腎小管損傷評(píng)分;*：與Sham組或者Sham+CR組相比,P<0.05;#與UI30R組相比,P<0.05;n=5

CR增強(qiáng)了腎缺血后自噬活性在表達(dá)RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報(bào)告小鼠IRI模型中發(fā)現(xiàn),AKI后小鼠腎小管細(xì)胞黃綠色及紅熒光均增強(qiáng),提示自噬活性增強(qiáng)。最值得關(guān)注的是,IRI后經(jīng)過(guò)CR處理組腎小管細(xì)胞紅色熒光尤為顯著增強(qiáng),提示自噬溶酶體形成增加(圖5A、B)。在C57BL/6J小鼠IRI模型中發(fā)現(xiàn),腎臟的細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白Beclin1水平上升。當(dāng)經(jīng)過(guò)CR處理后Beclin1表達(dá)更為顯著(圖5C)。LC3B免疫印跡結(jié)果同熒光結(jié)果一致(圖5D、E)。這些結(jié)果均表明,CR顯著增強(qiáng)了腎缺血后腎小管上皮細(xì)胞自噬活性。

圖4 C57BL/6J小鼠腎臟組織病理及間質(zhì)纖維化面積比Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;α-SMA:α平滑肌肌動(dòng)蛋白;A:腎組織Masson染色(×400);B:腎組織α-SMA組化染色(×400);C:間質(zhì)纖維化面積比;*:與Sham組或者Sham+CR組相比,P<0.05;#：與UI30R組相比,P<0.05;n=5

圖5 自噬報(bào)告小鼠腎臟組織RFP-GFP-LC3熒光、C57BL/6J小鼠Beclin1組化及LC3B免疫印跡代表圖LC3:微管相關(guān)蛋白輕鏈 3;Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:CR組激活自噬，自噬溶酶體形成(IF，×400);B:單位腎小管上皮細(xì)胞LC3點(diǎn)數(shù)半定量;C:Beclin1表達(dá)在CR組增高(IH，×400);D:LC3B免疫印跡;E:LC3Ⅱ/Ⅰ半定量分析；*：與Sham組相比,P<0.05;#：各組黃綠色點(diǎn)數(shù)相比,P<0.05;n=5>

CR對(duì)腎缺血性纖維化的影響在自噬被抑制后明顯減弱為了進(jìn)一步探討自噬在CR促進(jìn)小鼠的腎缺血性纖維化進(jìn)程的作用,我們將腎小管特異性ATG7基因敲除鼠分組行單側(cè)IRI及CR處理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎小管特異性ATG7敲除后,CR對(duì)小鼠的腎臟缺血性纖維化影響消失(圖6A～C)。同時(shí),在腎小管特異性ATG7敲除鼠中,CR對(duì)肌酐及尿素氮的影響也消失(圖6D、E)?？梢?jiàn),自噬被抑制以后CR對(duì)腎缺血性纖維化的影響消失。上述結(jié)果提示,IRI后CR處理可能由于過(guò)度激活自噬引起腎臟纖維化加重。CR影響缺血性腎臟纖維化的進(jìn)展同自噬密切相關(guān)。

圖6 ATG7敲除鼠腎臟組織病理和腎功能Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;α-SMA:α平滑肌肌動(dòng)蛋白;A:ATG7敲除后，CR對(duì)腎缺血性纖維化影響消失(Masson染色，×400);B:ATG7敲除后，CR組α-SMA表達(dá)與UI30R組無(wú)明顯差異(IH，×400);C:半定量分析;D:ATG7敲除后，CR組與UI30R組血清肌酐無(wú)明顯差異;E:ATG7敲除后，CR組與UI30R組血尿素氮無(wú)明顯差異;#:與UI30R組相比,P<0.05

討 論

在闡釋腎纖維化的機(jī)制和制訂相應(yīng)治療策略中,盡管許多研究者已作出了巨大努力,但在如何阻止腎纖維化進(jìn)展方面仍無(wú)可行的有效方案。近年來(lái),CR的研究較熱門(mén),而CR對(duì)腎缺血后纖維化進(jìn)程的影響目前尚無(wú)研究,本研究試圖探討了這一科學(xué)問(wèn)題。我們發(fā)現(xiàn)在IRI后,CR干預(yù)對(duì)腎臟IRI損傷后修復(fù)并未呈現(xiàn)出保護(hù)作用,反而加重了腎纖維化。

AKI后腎臟纖維化的過(guò)程中,成纖維細(xì)胞活化伴隨著炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生多種變化,包括部分上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞衰老和凋亡,導(dǎo)致腎小管萎縮。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,發(fā)生衰老和凋亡,導(dǎo)致微血管稀疏化[10]。所有這些細(xì)胞成分都可能通過(guò)分泌ECM成分、細(xì)胞外囊泡、可溶性因子和代謝產(chǎn)物來(lái)促進(jìn)腎臟纖維化的形成[11]。貫穿這一轉(zhuǎn)變過(guò)程需要大量能量的支持,CR必然帶來(lái)各種重新分配。如CR可誘導(dǎo)細(xì)胞代謝途徑轉(zhuǎn)向糖酵解[12]。另外,既往有研究指出,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激酶為營(yíng)養(yǎng)和能量感知的靶點(diǎn)[13]。mTOR通路又是自噬調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？梢?jiàn)CR影響較大的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞自噬。自噬是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行管理和質(zhì)量控制的生物現(xiàn)象,在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中均可見(jiàn)。研究證實(shí),當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí),原本處于低水平維持平衡生物分子的恒定合成的自噬,就會(huì)被大幅度上調(diào),這種變化增加了細(xì)胞的吸收和降解功能,將大分子物質(zhì)釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動(dòng)必需的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量[14-16]。自噬是各種疾病的重要調(diào)節(jié)器,其作用是正面的還是負(fù)面的尚未完全闡明[17-19]。已證實(shí),腎缺血性纖維化全過(guò)程中均存在自噬的變化,在缺血損傷的早期,大部分學(xué)者認(rèn)為發(fā)揮保護(hù)作用,但是在AKI后修復(fù)不良性的腎臟纖維化進(jìn)程中的作用尚不清楚,值得進(jìn)一步探討。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬可能通過(guò)加重脂毒性從而促進(jìn)了腎纖維化進(jìn)展[20]。故本研究探討了細(xì)胞自噬在AKI向CKD轉(zhuǎn)變過(guò)程中的影響。研究發(fā)現(xiàn),CR和IRI均可激活自噬,當(dāng)IRI組小鼠被CR處理3周后,自噬持續(xù)激活,且較單因素處理更強(qiáng)。我們?cè)诒磉_(dá)RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報(bào)告小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),CR處理IRI組小鼠后,小鼠近端小管的細(xì)胞自噬水平顯著增加,并且在手術(shù)后3周同樣能觀察到明顯的自噬小體和自溶小體的存在?？梢?jiàn),在AKI向CKD轉(zhuǎn)化的過(guò)程中,自噬的過(guò)度激活對(duì)腎臟損傷后的修復(fù)極為不利。由此我們推測(cè)CR通過(guò)進(jìn)一步激活自噬從而加重IRI后腎纖維化進(jìn)展,AKI之后抑制自噬的活性可能有助于延緩腎纖維化。

自噬相關(guān)基因ATG7編碼泛素E樣連接酶,在ATG12與ATG5結(jié)合前激活A(yù)TG12,促進(jìn)前吞噬體的擴(kuò)張,ATG7還促進(jìn)蛋白質(zhì)LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)化,產(chǎn)生LC3Ⅱ。ATG7全敲除小鼠出生24 h內(nèi)死亡[21]。由此可見(jiàn),ATG7是自噬現(xiàn)象中的關(guān)鍵基因,所以我們選擇ATG7條件敲除小鼠作為研究對(duì)象,探討自噬阻斷后CR對(duì)腎臟缺血損傷后的修復(fù)情況。干預(yù)細(xì)胞自噬對(duì)小鼠AKI-CKD進(jìn)程中有什么影響呢?本研究通過(guò)條件性腎小管ATG7敲除小鼠進(jìn)行IRI后,給予CR處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATG7敲除后,CR干預(yù)組腎臟纖維化程度與非CR組相當(dāng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),腎臟纖維化促進(jìn)因子TGF-β1、PDGFB、CTGF和FGF2的表達(dá)在AKI之后均顯著上調(diào),在ATG7敲除小鼠中僅觀察到FGF2較低,這一研究提示自噬可能促進(jìn)了FGF2的分泌[8]。在本研究中,ATG7敲除后消除了CR對(duì)IRI后腎臟慢性化進(jìn)程的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證了CR可通過(guò)進(jìn)一步激活自噬加重AKI后的腎纖維化。既往學(xué)者證實(shí)AKI前CR處理具有腎臟保護(hù)作用,而我們?cè)贏KI后CR加重腎損傷。這一現(xiàn)象提示,CR激活自噬在AKI的不同階段將發(fā)揮不同的作用。然另有研究發(fā)現(xiàn),衰老使腎脂肪酸氧化途徑活性降低,促進(jìn)腎纖維化表型。而CR可改善衰老過(guò)程中受損的腎脂肪酸氧化途徑,減緩了纖維化進(jìn)程[22]。同時(shí)衰老也伴自噬功能障礙[23]?？梢?jiàn)CR在誘發(fā)纖維化的背景及干預(yù)時(shí)間不同的情況下,對(duì)腎纖維化的影響截然相反。在臨床工作中,對(duì)預(yù)判可能發(fā)生AKI的患者適當(dāng)?shù)腃R預(yù)處理可能有助于預(yù)防AKI的發(fā)生或減輕AKI的程度,而對(duì)于AKI后的患者保持充足的熱量供應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)腎損傷的修復(fù),阻止或延緩纖維化的進(jìn)展。

總之,本研究為防治AKI后腎纖維化提供了新思路。在AKI后的修復(fù)過(guò)程中,細(xì)胞自噬可能影響腎纖維化促進(jìn)因子的分泌。因此,在腎移植受者恢復(fù)期給予充足熱量供應(yīng)是非常重要的,同時(shí)我們可通過(guò)抑制自噬緩解AKI向CKD的轉(zhuǎn)變,這為腎移植受者的恢復(fù)期需要足夠的熱量提供了重要依據(jù)。