UPLC-MS/MS法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)片中芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素的含量

孫 敏 鄭 林 劉麗娜，

（1.西南藥業(yè)股份有限公司，中國(guó) 重慶 400030；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

婦科調(diào)經(jīng)片是中國(guó)藥典2010年版一部收載的品種[1]，具有養(yǎng)血柔肝，理氣調(diào)經(jīng)的功效，用于肝郁血虛所致的月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)期前后不定、行經(jīng)腹痛，臨床應(yīng)用廣泛，療效確切。《中國(guó)藥典》2010年版以當(dāng)歸、川芎中的阿魏酸作為其質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，而對(duì)其他藥味缺乏含量測(cè)定指標(biāo)，難以全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)婦科調(diào)經(jīng)片質(zhì)量。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[2-3]，目前也僅有采用高效液相色譜法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)片中芍藥苷、延胡索乙素等單一成分的報(bào)道。因此，研究建立婦科調(diào)經(jīng)片多個(gè)主要成分的含量測(cè)定方法，對(duì)提高婦科調(diào)經(jīng)片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有重要的應(yīng)用意義。液質(zhì)聯(lián)用法由于專屬性強(qiáng)、靈敏度高，已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中[4-6]。故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS 法對(duì)婦科調(diào)經(jīng)片中芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，為有效控制婦科調(diào)經(jīng)片的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

ACQUITYTM 系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站）。

芍藥苷（批號(hào)110736-200320）、阿魏酸（批號(hào)110773-9910）和延胡索乙素（批號(hào)0726-200208）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。婦科調(diào)經(jīng)片（市售品，廣西某廠家，批號(hào)：090803，河南某廠家，批號(hào)：290006；湖北某廠家，批號(hào):090213）。乙腈、甲酸為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

WATERS ACQUITY BEH Cl8 色譜柱（2.1mm×150mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%甲酸銨的0.1%甲酸溶液，線性梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速為0.25mL·min-1；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2 質(zhì)譜條件

離子源電噴霧電離源(ESI)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度125℃；去溶劑氣N2，流速800 L·h-1；去溶劑氣溫度360℃；離子源溫度115℃；碰撞氣Ar，流速0.18 mL·min-1；檢測(cè)模式多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z(-)525→121（芍藥苷）；m/z(-)193→134（阿魏酸）；m/z(+)356→192（延胡索乙素）。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10 片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理60min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同法，制得缺當(dāng)歸、川芎、白芍、赤芍、醋延胡索的陰性樣品溶液。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素對(duì)照品適量，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每毫升含芍藥苷0.143mg、阿魏酸0.102 mg 和延胡索乙素0.082mg 的對(duì)照品混合液，搖勻，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各1μL，分別進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品溶液中被測(cè)定化合物與3個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間相同。比較被測(cè)定成分和對(duì)照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖，兩者一致，且陰性樣品溶液在芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素色譜峰處無(wú)干擾，表明本法專屬性良好。

圖1 對(duì)照品溶液（A）；樣品溶液（B）；陰性樣品溶液（C）

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，依次用甲醇逐級(jí)稀釋，制得5個(gè)濃度的系列濃度線性工作液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素的線性回歸方程分別為:Y=4934909X-7794 r=0.9999；Y=7287380X-11541r=0.9996；Y=4944101X+1346r=0.9998；結(jié)果表明芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素濃度分別在4.47～143.00，3.19～102.00，2.57～82.00 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素峰面積的RSD(n=6)為0.86%，0.43%，1.02%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批婦科調(diào)經(jīng)片樣品(批號(hào)090803)，共6 份，按“供試品溶液”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素的平均含量(n=6)分別為0.78 mg·g-1，0.23 mg·g-1，0.62 mg·g-1；RSD(n=6)分別為2.16%，1.87%，1.53%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批婦科調(diào)經(jīng)片樣品(批號(hào)090803)，分別在0，1，2，4，8，12 h 進(jìn)樣分析，測(cè)得芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素峰面積的RSD(n=6)分別為0.81%，2.03%，1.76%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取6 份已知含量的婦科調(diào)經(jīng)片樣品(批號(hào)090803)約0.5g，分別精密加入74.4μg·mL-1芍藥苷、25.4μg·mL-1阿魏酸和64.8μg·mL-1延胡索乙素混合對(duì)照品溶液5 mL，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.7 樣品測(cè)

取不同廠家生產(chǎn)的3 批婦科調(diào)經(jīng)片，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各2μL，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/片）

3 討論

（1）婦科調(diào)經(jīng)片處方由當(dāng)歸、川芎、醋香附、麩炒白術(shù)、白芍、赤芍、醋延胡索、熟地黃、大棗、甘草十味中藥材組成。當(dāng)歸、川芎中所含的阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用。白芍、赤芍中所含的芍藥苷具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、解熱解痙等作用。醋延胡索中所含的延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠及安定等作用。因此，本文結(jié)合婦科調(diào)經(jīng)片處方藥味的主要化學(xué)成分及其藥理作用，選擇阿魏酸、芍藥苷和延胡索乙素作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，可較為全面準(zhǔn)確地控制婦科調(diào)經(jīng)片質(zhì)量。

（2）實(shí)驗(yàn)中分別應(yīng)用HPLC 和UPLC-MS/MS 測(cè)定了婦科調(diào)經(jīng)片的含量，結(jié)果表明，UPLC-MS/MS 靈敏度更高，專屬性強(qiáng)，樣品處理簡(jiǎn)單，且由于UPLC 使用1.7μm 顆粒度的色譜柱填料，能顯著提高分離的效率從而達(dá)到顯著縮短分析時(shí)間的目的。因此，UPLC-MS/MS 應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的分析測(cè)定有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

（3）對(duì)市場(chǎng)上3個(gè)廠家的婦科調(diào)經(jīng)片分析結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)制劑中所含的芍藥苷、阿魏酸和延胡索乙素含量存在明顯差異，可能由于不同廠家的原料藥材來(lái)源和質(zhì)量有差異所致。上述結(jié)果提示，為保證不同批次間婦科調(diào)經(jīng)片質(zhì)量的一致性，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)原料藥材的質(zhì)量控制，必要時(shí)固定藥材的來(lái)源。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)，編.中國(guó)藥典:一部[M].2010:730.

［2］邵志偉.HPLC法測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)片中芍藥苷的含量[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(5):418.

［3］周作光.HPLC 測(cè)定婦科調(diào)經(jīng)片中延胡索乙素的含量[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，10(4):77.

［4］黃勇，何峰，張治蓉，等.HPLC-MS-MS 同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中葒草素、牡荊素和槲皮苷[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(1):80-83.

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