LncRNA BDNF-AS靶向miR-335-5p調(diào)控高糖誘導的小鼠足細胞損傷的分子機制

杜燕 李莎莎 徐夢露 劉曉茜 郭曉莉

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西 西安 710077)

足細胞是腎小球臟層上皮細胞，是腎小球濾過的最后一道屏障，足細胞的損傷會導致蛋白濾出，形成蛋白尿，與腎小球疾病密切相關(guān)〔1〕。足細胞在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用〔2〕。因此，保護足細胞損傷可成為治療相關(guān)腎小球疾病的重要手段。LncRNA廣泛參與多種生物學過程，還與腎小球足細胞損傷、腎小管上皮細胞損傷、腎小球系膜細胞的增殖和纖維化、腎小球細胞外基質(zhì)積聚等病理生理過程相關(guān)〔3〕。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種多效性神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)其對于腎小球發(fā)育、形態(tài)和功能至關(guān)重要，可有效修復足細胞損傷〔4，5〕。BDNF反義因子(BDNF-AS)是一種LncRNA，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LncRNA BDNF-AS的表達可保護高糖誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡〔6〕。沉默LncRNA BDNF-AS通過抑制細胞凋亡和氧化應激可減弱PC12細胞中Aβ25～35誘導的神經(jīng)毒性〔7〕。研究表明miRNA可通過調(diào)控足細胞在腎小球疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔8〕。高糖狀態(tài)下，miR-335-5p促進成骨細胞的增殖，抑制細胞凋亡〔9〕。miR-335通過抑制超氧化物歧化酶(SOD)2表達增加了氧化誘導的視網(wǎng)膜色素上皮細胞損傷〔10〕。然而LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p對足細胞損傷的影響及其機制還尚未可知。本實驗通過高糖誘導小鼠腎臟足細胞MPC5建立足細胞損傷模型，研究LncRNA BDNF-AS對足細胞損傷的影響及其機制是否與miR-335-5p相關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠腎臟足細胞系MPC5購自上海名勁生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；載體質(zhì)粒購自上海斯信生物科技有限公司；Light Cycler480熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購自上海仁科生物科技有限公司；流式細胞儀、Power Pac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 MPC5細胞在37℃、5%CO2，含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞無血清饑餓培養(yǎng)12 h后用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培養(yǎng)細胞48 h作為高糖(HG)組，同時以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細胞作為正常對照(NG)組。將si-NC、si-BDNF-AS、miR-NC、miR-335-5p分別轉(zhuǎn)染至MPC5細胞中再用HG處理，記為HG+si-NC組、HG+si-BDNF-AS組、HG+miR-NC組、HG+miR-335-5p組。將pcDNA、pcDNA-BDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS轉(zhuǎn)染至MPC5細胞中，記為pcDNA組、pcDNA-BDNF-AS組、si-NC組和si-BDNF-AS組。將si-BDNF-AS與anti-miR-NC、annti-miR-335-5p分別共同轉(zhuǎn)染至MPC5細胞中再用HG處理，記為HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、HG+si-BDNF-AS+antimiR-335-5p組；轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行。

1.2.2實時熒光定量(qRT)-PCR檢測miR-335-5p和BDNF-AS表達水平 細胞培養(yǎng)48 h后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR擴增，每個樣品重復3次，反應條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-335-5p和BDNF-AS分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-335-5p正向引物：5′-GCGTCAAGAGCAATAACG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-TGCAGAGGATCTAATT-3′，反向引物：5′-GAAAGACCAGTCCAAGTCC-3′。BDNF-AS正向引物：5′-TACCACAAGGTACCAACCATATATG-3′，反向引物：5′-CATGTGGTTCTGTTTCAATGCCC-3′；GAPDH正向引物：5′-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3′，反向引物：5′-GAGTGATTTTCCCGTCC-3′；引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.3Western印跡檢測podocin、nephrin、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3蛋白表達 細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，后顯影，定影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心收集后用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，重懸細胞。先后加入Annexin V-FITC和PI各5 μl避光孵育30 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.5熒光素酶實驗檢測BDNF-AS對miR-335-5p的靶向調(diào)控 構(gòu)建野生型和突變型基因靶點BDNF-AS的3′UTR熒光素酶表達載體WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS，用LipofectamineTM2000將miR-NC和miR-335-5p分別轉(zhuǎn)染至MPC5細胞中，再將WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS分別轉(zhuǎn)染至其中，培養(yǎng)48 h后各組細胞中加入熒光素酶試劑盒酶反應底物，充分作用后，測定各組細胞中相對熒光強度。實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1干擾LncRNA BDNF-AS和miR-335-5p對HG誘導的小鼠足細胞中podocin及nephrin蛋白表達的影響 與NG組相比，HG組足細胞LncRNA BDNF-AS表達水平顯著升高，miR-335-5p、podocin、nephrin蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；與HG+si-NC組相比，HG+si-BDNF-AS組LncRNA BDNF-AS表達水平顯著降低，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測podocin及nephrin蛋白的表達

2.2干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組足細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；與HG+si-NC組相比，HG+si-BDNF-AS組細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表1、圖2，圖3。

1～4：NG組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-BDNF-AS組圖2 Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達

圖3 干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.3miR-335-5p過表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-335-5p組miR-335-5p表達水平顯著升高，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4、圖5，表2。

圖4 Western印跡檢測podocin、nephrin和凋亡相關(guān)蛋白的表達

圖5 miR-335-5p過表達對HG誘導的小鼠足細胞凋亡的影響

2.4LncRNA BDNF-AS靶向調(diào)控miR-335-5p的表達 LncBase在線軟件預測到BDNF-AS與miR-335-5p存在結(jié)合位點。見圖6。轉(zhuǎn)染野生型和突變型表達載體WT-BDNF-AS和MUT-BDNF-AS后，相較于miR-NC組，miR-335-5p組WT-BDNF-AS鼠足細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。相較于si-NC組miR-335-5p表達水平(1.01±0.09)，si-BDNF-AS組(2.36±0.23)顯著升高(P<0.05)；相較于pcDNA組miR-335-5p表達水平(1.00±0.08))，pcDNA-BDNF-AS組(0.52±0.05)顯著降低(均P<0.05)。表明BDNF-AS可靶向調(diào)控miR-335-5p。

圖6 BDNF-AS的序列中含有與miR-335-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5抑制miR-335-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的作用 與HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組相比，HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p組miR-335-5p表達水平顯著降低，podocin、nephrin蛋白表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、酶切caspase3蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05)。見圖7、表4、圖8。

1～2：HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、HG+si-BDNF-AS+anti-miR-335-5p組；下圖同圖7 Western印跡檢測各組podocin、nephrin和凋亡相關(guān)蛋白的表達

圖8 抑制miR-335-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾LncRNA BDNF-AS表達對HG誘導的小鼠足細胞損傷的作用

3 討 論

足突之間裂孔膜蛋白的完整性是腎小球機械過濾屏障的關(guān)鍵，其蛋白表達下降會引起足細胞結(jié)構(gòu)和功能障礙從而導致尿蛋白的產(chǎn)生〔11〕。裂孔膜蛋白podocin、nephrin是維持足細胞裂孔隔膜蛋白形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，使腎小球發(fā)揮正常的濾過功能，從而減少蛋白尿漏出的重要分子〔12〕。本研究結(jié)果說明HG導致了足細胞損傷，使其產(chǎn)生功能障礙。

抑制LncRNA BDNF-AS可保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺血性損傷〔13〕。抑制LncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復氧受損鼠心肌細胞的細胞死亡和凋亡〔14〕。抑制LncRNA BDNF-AS通過下調(diào)miR-130b-5p在急性脊髓損傷中抑制神經(jīng)細胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果說明干擾LncRNA BDNF-AS表達可抑制HG誘導的足細胞凋亡，保護HG誘導的足細胞損傷。

研究報道m(xù)iR-335-5p靶向抑制血清可溶性klotho蛋白(sKlotho)并促進氧化應激介導的內(nèi)皮細胞衰老〔16〕。敲低SLCO4A1-AS1通過miR-335-5p抑制膀胱癌的生長和侵襲〔17〕。 本研究結(jié)果說明過表達miR-335-5p可抑制HG誘導的足細胞凋亡，保護HG誘導的足細胞損傷，提示LncRNA BDNF-AS可能通過調(diào)控miR-335-5p保護HG誘導的足細胞損傷。綜上，HG作用的小鼠足細胞中LncRNA BDNF-AS低表達，過表達LncRNA BDNF-AS可抑制細胞凋亡，保護HG誘導的小鼠足細胞損傷，其機制可能與miR-335-5p的表達相關(guān)。