異補(bǔ)骨脂素通過(guò)LncRNA THOR/miR-153-5p影響喉癌細(xì)胞Tu686增殖、遷移和侵襲的機(jī)制

徐茂林 陳曉華

(淄博市第一醫(yī)院 1耳鼻咽喉科，山東 淄博 255200；2口腔科)

喉癌是耳鼻咽喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在頭頸部原發(fā)惡性腫瘤中排名第二〔1，2〕。喉癌以男性患者居多，而女性則相對(duì)少見(jiàn)〔3〕。大多數(shù)喉癌由鱗狀細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，因此被稱為鱗狀細(xì)胞癌〔1〕?，F(xiàn)階段，雖然醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)改善了喉癌的治療，包括手術(shù)、化療、放療、靶向藥物等，但并不能提高喉癌患者的整體生存率〔4，5〕。提高喉癌的早期診斷率，早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)及給予有效的干預(yù)措施是提高喉癌療效的關(guān)鍵〔6，7〕。異補(bǔ)骨脂素是一種呋喃香豆素類化合物，是中藥補(bǔ)骨脂最重要的活性成分之一〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有明顯抑制作用〔9〕，并通過(guò)抑制細(xì)胞自噬抑制人宮頸癌的惡性行為〔10〕。然而異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未可知。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)已被報(bào)道是參與喉癌進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，如LncRNA INK4位點(diǎn)反義非編碼RNA(ANRIL)通過(guò)調(diào)控miR-181a/鋅指神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(Snai)2軸促進(jìn)喉部鱗癌的增殖、克隆、侵襲和遷移〔11〕，LncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)3通過(guò)調(diào)節(jié)miR-384/WEE1軸調(diào)控喉癌的增殖和遷移〔12〕。資料顯示，LncRNA睪丸相關(guān)的高保守的致癌長(zhǎng)鏈非編碼RNA(THOR)在人的鼻咽癌組織和細(xì)胞中升高，LncRNA THOR的敲除抑制小鼠鼻咽癌異種移植腫瘤的生長(zhǎng)〔13〕。miR-153-5p與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，環(huán)狀RNA(Circ RNA)Pan3基因第2～5外顯子(PAN3)通過(guò)miR-153-5p/miR-183-5p-X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)軸介導(dǎo)急性髓系白血病耐藥〔14〕，LncRNA CDKN2BAS可預(yù)測(cè)肝癌患者的不良預(yù)后，并通過(guò)miR-153-5p/ARHGAP18信號(hào)軸促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移〔15〕。但LncRNA THOR與miR-153-5p在喉癌中的生物學(xué)功能仍不清楚。既往研究表明，雷公藤內(nèi)酯酮通過(guò)阻斷LncRNA THOR-胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP)1信號(hào)傳導(dǎo)在體內(nèi)和體外抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔13〕，異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響是否與調(diào)控LncRNA THOR/miR-153-5p表達(dá)有關(guān)，值得探索。因此，本研究考察異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并對(duì)異補(bǔ)骨脂素是否通過(guò)LncRNA THOR/miR-153-5p影響喉癌細(xì)胞Tu686增殖、遷移和侵襲進(jìn)行探討，旨在闡明其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 喉癌Tu686細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，異補(bǔ)骨脂素(含量為99.5%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞核相關(guān)抗原(Ki-67)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自博士德生物公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)相關(guān)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Trizol試劑、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，si-LncRNA THOR、miR-153-5p、pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p及各自陰性對(duì)照、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理 Tu686細(xì)胞中加入RPMI1640培養(yǎng)基，其中包含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素，于37℃、5% CO2、飽和濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入10、30、90 μg/ml〔8〕濃度的異補(bǔ)骨脂素，分別作為異補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組，將正常培養(yǎng)的Tu686細(xì)胞設(shè)為空白組，處理48 h后用于各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 Tu686細(xì)胞以1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，棄去原有培養(yǎng)基，分別加入10、30、90 μg/ml濃度的異補(bǔ)骨脂素溶液，空白組不含異補(bǔ)骨脂素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μl 0.5%的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩培養(yǎng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定Tu686細(xì)胞吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲 Tu686細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：Tu686細(xì)胞使用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整2×104個(gè)/ml的密度，在Transwell上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，孵育24 h，無(wú)菌棉簽擦去多余細(xì)胞，4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，記錄細(xì)胞遷移數(shù)。Tu686細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：將基質(zhì)膠與無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基按1:5的比例稀釋，吸取50 μl于上室，靜置3～4 h。其余操作同Tu686細(xì)胞遷移能力檢測(cè)。

1.5Western印跡檢測(cè)Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 收集Tu686細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰上提取細(xì)胞的蛋白。30 μg蛋白樣品加入10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9(1∶1 000稀釋)抗體4℃孵育過(guò)夜，使用TBST溶液洗PVDF膜10 min，洗滌3次，化學(xué)發(fā)光液顯影，Image J軟件分析蛋白灰度值。β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。

1.6qPCR檢測(cè)LncRNA THOR和miR-153-5p表達(dá) 使用TRIzol試劑提取Tu686細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。以cDNA為模板，進(jìn)行qPCR。LncRNA THOR正向引物序列為5′-CAAGGTGCTTCTCTCTGGATTT-3′，反向引物序列為5′-GCCAAAGTCATTTGTTGGGTAT-3′。miR-153-5p正向引物序列為5′-GGTGGCCAGTGTCATTTTTGT-3′，反向引物序列為5′-TTGTGACTATGCAACTGGGCT-3′。內(nèi)參U6正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物序列為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。根據(jù)Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA THOR和miR-153-5p表達(dá)。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)DINAN工具預(yù)測(cè)到LncRNA THOR與miR-153-5p的3′非編碼區(qū)(3′UTR)具有靶向結(jié)合序列。分別構(gòu)建包含miR-153-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型LncRNA THOR(WT-THOR)和突變型LncRNA THOR(MUT-THOR)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000試劑，將WT-THOR、MUT-THOR分別與miR-con、miR-153-5p共轉(zhuǎn)染，48 h后檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將5×105個(gè)/ml的Tu686細(xì)胞接種于6孔板，觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，嚴(yán)格依照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)的指示，將si-LncRNA THOR、miR-153-5p、pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。其中，轉(zhuǎn)染pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p的Tu686細(xì)胞使用90 μg/ml異補(bǔ)骨脂素處理，48 h后參照1.3～1.6中的方法檢測(cè)細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞增殖和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，異補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組明顯減少Tu686細(xì)胞中Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率，并呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

1～4：空白組，異補(bǔ)骨脂素低濃度組，異補(bǔ)骨脂素中濃度組，異補(bǔ)骨脂素高濃度組；圖2同圖1 Western印跡檢測(cè)喉癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，異補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組顯著減少Tu686細(xì)胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)喉癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞LncRNA THOR和miR-153-5p表達(dá)的影響 與空白組比較，異補(bǔ)骨脂素低、中、高濃度組明顯減少Tu686細(xì)胞內(nèi)LncRNA THOR表達(dá)量，而顯著增加miR-153-5p表達(dá)量，均呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度的異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞LncRNA THOR和miR-153-5p表達(dá)的影響

2.4LncRNA THOR靶向調(diào)控miR-153-5p DINAN工具預(yù)測(cè)出LncRNA THOR與miR-153-5p存在互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列(圖3)。與miR-con組比較，miR-153-5p明顯降低WT-THOR熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，對(duì)MUT-THOR熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著影響(表3)。與si-con組(0.97±0.05)比較，轉(zhuǎn)染si-LncRNA THOR明顯增加miR-153-5p表達(dá)量(5.17±0.64，P<0.05)；與pcDNA組(0.99±0.07)比較，轉(zhuǎn)染pcDNA-LncRNA THOR顯著減少miR-153-5p表達(dá)量(0.53±0.08，P<0.05)。

圖3 LncRNA THOR與miR-153-5p存在靶向序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5沉默LncRNA THOR或過(guò)表達(dá)miR-153-5p抑制喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與si-con組比較，沉默LncRNA THOR明顯減少Tu686細(xì)胞的LncRNA THOR表達(dá)量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)，顯著提高miR-153-5p表達(dá)量(P<0.05)。與miR-con組比較，過(guò)表達(dá)miR-153-5p明顯降低Tu686細(xì)胞的LncRNA THOR表達(dá)量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白水平、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)，顯著增加miR-153-5p表達(dá)量(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

1～4：si-con組、si-LncRNA THOR組、miR-con組、miR-153-5p組圖4 Western印跡檢測(cè)喉癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的表達(dá)

2.6過(guò)表達(dá)LncRNA THOR或干擾miR-153-5p部分逆轉(zhuǎn)異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞的抑制作用 與異補(bǔ)骨脂素+pcDNA組比較，過(guò)表達(dá)LncRNA THOR明顯增加異補(bǔ)骨脂素處理的Tu686細(xì)胞中LncRNA THOR表達(dá)量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)，顯著減少miR-153-5p表達(dá)量(P<0.05)。與異補(bǔ)骨脂素+anti-miR-con組比較，干擾miR-153-5p明顯減少異補(bǔ)骨脂素處理后Tu686細(xì)胞的LncRNA THOR表達(dá)量，顯著增加miR-153-5p表達(dá)量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖5。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有明顯的抑制作用，顯示出治療喉癌的潛力。喉癌敏感生物標(biāo)志物的有效篩選和應(yīng)用是喉癌診斷和治療的關(guān)鍵。本研究還發(fā)現(xiàn)，LncRNA THOR和miR-153-5p與喉癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密，沉默LncRNA THOR或過(guò)表達(dá)miR-153-5p能夠抑制喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而調(diào)控LncRNA THOR/miR-153-5p表達(dá)可能解釋了異補(bǔ)骨脂素對(duì)喉癌的細(xì)胞毒性作用，為喉癌診治提供了有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

補(bǔ)骨脂始載于《開(kāi)寶本草》〔8〕，來(lái)源于豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)，納氣平喘，溫脾止瀉的功效，外用能夠消風(fēng)祛斑，臨床用于腎陽(yáng)不足，陽(yáng)痿遺精，遺尿尿頻，腰膝冷痛，腎虛作喘，五更泄瀉，外用治白癜風(fēng)，斑禿〔16〕。異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的質(zhì)控指標(biāo)之一，現(xiàn)代藥理研究顯示，異補(bǔ)骨脂素具有抗腫瘤〔17〕、抗炎〔18〕、雌激素樣〔19〕、抗骨質(zhì)疏松〔20〕、抗氧化〔21〕等作用。根據(jù)報(bào)道，異補(bǔ)骨脂素可明顯誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞周期，以劑量依賴的方式抑制了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的遷移，另外，A549細(xì)胞經(jīng)異補(bǔ)骨脂素處理后，MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著降低，異補(bǔ)骨脂素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期并抑制人肺癌A549細(xì)胞的遷移而發(fā)揮抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性〔22〕。異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂素對(duì)骨肉瘤裸鼠移植瘤具有生長(zhǎng)抑制作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死，對(duì)骨髓沒(méi)有明顯的毒性副作用〔23〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究〔22〕一致，提示異補(bǔ)骨脂素可以抑制喉癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有抑癌的作用。

有證據(jù)支持LncRNA和miRNA在人類生理和病理過(guò)程，包括喉癌〔24〕。LncRNA是一類內(nèi)源RNA分子，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA。LncRNA THOR是LncRNA家族的成員，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在腫瘤進(jìn)展中起重要作用。LncRNA THOR在人膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲除LncRNA THOR可有效抑制細(xì)胞存活和增殖，同時(shí)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，其過(guò)表達(dá)則促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移〔25〕。在人類骨肉瘤組織中也檢測(cè)到LncRNA THOR的表達(dá)，但在周圍正常骨組織中沒(méi)有，敲除LncRNA THOR可顯著抑制人骨肉瘤細(xì)胞的存活和增殖，LncRNA THOR的過(guò)表達(dá)具有相反的作用〔26〕，表明LncRNA THOR在癌癥中可能充當(dāng)致癌基因，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-153-5p被報(bào)道在癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，沉默LncRNA THOR或過(guò)表達(dá)miR-153-5p可以抑制喉癌Tu686細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，而調(diào)控LncRNA THOR/miR-153-5p的表達(dá)可能是異補(bǔ)骨脂素發(fā)揮抗喉癌活性的重要途徑之一。

綜上，異補(bǔ)骨脂素通過(guò)抑制喉癌Tu686細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，顯示出一定的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移活性。這些作用的分子機(jī)制與調(diào)控LncRNA THOR和miR-153-5p表達(dá)有關(guān)。此外，沉默LncRNA THOR或過(guò)表達(dá)miR-153-5p對(duì)喉癌Tu686細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。因此，異補(bǔ)骨脂素可能是用于治療喉癌的潛在治療劑，LncRNA THOR/miR-153-5p可能成為人類喉癌新的治療靶點(diǎn)和(或)診斷標(biāo)記。