劍葉鳳尾蕨乙醇提取物調(diào)控LOXL1-AS1抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲

李蔚 鄔海橋 李炯 張俊娜 向茜 馮霞

(重慶市中醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400021)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年約有180萬(wàn)肺癌新增病例〔1〕。約85%的肺癌病例為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，早期NSCLC患者經(jīng)手術(shù)治療后其5年生存率可顯著提高，然而70%的NSCLC患者在確診時(shí)已處于晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移。化療盡管可延長(zhǎng)NSCLC患者生存期，但多數(shù)患者在治療后易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療失敗。天然中草藥提取物具有較好的抗腫瘤活性引起研究者的廣泛關(guān)注〔2〕。劍葉風(fēng)尾蕨是鳳尾蕨屬多年生常綠草本植物，具有清熱消食、利尿止痢作用。研究顯示其乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW579、肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞BGC-823及肺癌細(xì)胞H23具有一定的增殖抑制作用〔3，4〕。但目前劍葉鳳尾蕨對(duì)肺癌的遷移、侵襲及增殖的影響及其機(jī)制還未有研究。類(lèi)賴(lài)氨酰氧化酶1反義RNA1(LOXL1-AS1)是近年發(fā)現(xiàn)的新型的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，研究顯示，LOXL1-AS1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌中具有致癌作用，敲除LOXL1-AS1可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲〔5，6〕。對(duì)NSCLC微陣列分析顯示，LOXL1-AS1在肺癌組織中的表達(dá)高于正常組織〔7〕，但其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及劍葉鳳尾蕨乙醇提取物能否調(diào)控LOXL1-AS1表達(dá)參與對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控尚未可知。本研究擬通過(guò)觀察不同濃度劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲及LOXL1-AS1表達(dá)的影響，初步揭示其調(diào)控肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細(xì)胞A549購(gòu)于美國(guó)ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、LOXL1-AS1小干擾RNA(si-LOXL1-AS1)、空載體質(zhì)粒(pcDNA3.1)、LOXL1-AS1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.1-LOXL1-AS1)購(gòu)于上海吉瑪制藥有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；兔源細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、兔源p21抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體及山羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；鼠源E鈣黏附蛋白(E-cadherin)抗體及山羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；Trizol試劑喝RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天公司；LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 A549細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃、含5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞分為0 mg/ml組、3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組、si-NC組、si-LOXL1-AS1組、劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組和劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組。3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組為分別采用劍葉鳳尾蕨乙醇提取物濃度為3、6、12 mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理A549細(xì)胞48 h。si-NC組、si-LOXL1-AS1組分別為轉(zhuǎn)染si-NC、si-LOXL1-AS1的A549細(xì)胞。劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組和劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組為分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOXL1-AS1轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后，采用含6 mg/ml的劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的細(xì)胞培養(yǎng)液處理48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000使用說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3方法

1.3.1劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的制備 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的制備參考文獻(xiàn)〔4〕進(jìn)行，具體如下：將劍葉鳳尾蕨于陰涼處晾干，粉碎后，取10 g樣品加乙醇100 ml利用索氏抽提器連續(xù)回流提取8 h，稀釋提取液至乙醇含量為30%，將石油醚Ⅱ和提取液按照1∶2比例混合后萃取2次，棄去石油醚層，合并萃取蒸干后，加入適量二甲基亞砜溶解，磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，獲得1 g/ml的提取液，滅菌后，置于4℃冰箱備用。

1.3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活 將A549細(xì)胞按照5×103個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入含不同濃度劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液200 μl，另外設(shè)置對(duì)照(0 mg/ml)組只添加200 μl的RPMI1640培養(yǎng)基，孵育48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細(xì)胞和0 mg/ml組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次后，用無(wú)血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。將包被基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行基底膜水化后，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，24孔板下室加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕拭去上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色后，將Transwell小室倒置于顯微鏡下觀察細(xì)胞過(guò)膜情況，隨即選取5個(gè)視野拍照和細(xì)胞記數(shù)，取均值即為侵襲細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.4Western印跡檢測(cè)CyclinD1、p21、E-cadherin和MMP-2蛋白的表達(dá) 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細(xì)胞和0 mg/ml組細(xì)胞，利用PIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度。將蛋白樣品與2×上樣緩沖液以1∶1比例混合，沸水浴變性5 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白。電泳結(jié)束后后，將細(xì)胞蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，采用5%脫脂牛奶中室溫封閉膜1 h，TBST洗膜2 min，加入Ⅰ抗(p21抗體1∶1 000稀釋?zhuān)瑑?nèi)參GAPDH抗體1∶2 500稀釋?zhuān)渌贵w稀釋比例為1∶500)側(cè)擺搖床室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)側(cè)擺搖床室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑于暗室內(nèi)顯色，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白的灰度值。

1.3.5qRT-PCR檢測(cè)LOXL1-AS1的表達(dá)水平 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細(xì)胞和0 mg/ml組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)LOXL1-AS1的表達(dá)水平。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：LOXL1-AS1上游引物序列5′-TTCCCATTTACCTGCCCGAAG-3′，下游引物序列5′-GTCAGCAAACACATGGCAAC-3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAAGGACTCATGACCACAGTCC-3′，下游引物序列5′-TCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGACC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算LOXL1-AS1的表達(dá)水平。

1.3.6抑制LOXL1-AS1對(duì)細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 將A549細(xì)胞按照5×103個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約為60%時(shí)，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別將si-NC、si-LOXL1-AS1轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h按照1.3.2步驟檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.7過(guò)表達(dá)LOXL1-AS1逆轉(zhuǎn)劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOXL1-AS1轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，采用含6 mg/ml的劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的細(xì)胞培養(yǎng)液處理48 h。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響 與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低，p21蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

1～4：0 mg/ml組、3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組，下圖同圖1 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549增殖蛋白表達(dá)的影響

2.2劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影響 與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細(xì)胞后，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少，E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著升高，MMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

圖2 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.3劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549中LOXL1-AS1表達(dá)的影響 0、3、6、12 mg/ml組A549細(xì)胞中LOXL1-AS1表達(dá)水平分別為〔(1.01±0.10)、(0.70±0.07)、(0.47±0.04)、(0.23±0.02)〕，與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細(xì)胞后，A549細(xì)胞中LOXL1-AS1的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。

2.4抑制LOXL1-AS1對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LOXL1-AS1組A549細(xì)胞LOXL1-AS1的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞存活率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，p21和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 抑制LOXL1-AS1對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.5過(guò)表達(dá)LOXL1-AS1能逆轉(zhuǎn)劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響 與劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組A549細(xì)胞LOXL1-AS1的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率顯著升高，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著升高，p21蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖4。

1，2：劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組、劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1，下圖同圖4 過(guò)表達(dá)LOXL1-AS1能逆轉(zhuǎn)劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549增殖蛋白表達(dá)的影響

2.6過(guò)表達(dá)LOXL1-AS1能逆轉(zhuǎn)劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影響 與劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組A549細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目顯著增加，MMP-2蛋白的表達(dá)顯著升高，E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表4。

圖5 過(guò)表達(dá)LOXL1-AS1能逆轉(zhuǎn)劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首，已造成嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔8，9〕。盡管肺癌治療方案不斷進(jìn)展，肺癌患者的預(yù)后仍然很差，患者的5年生存率約為15%〔10〕。

研究顯示中草藥提取物在肺癌治療中有一定療效〔11〕。白花蛇舌草通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔12〕。巖黃連提取物可抑制裸鼠A549細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，減輕肺癌骨轉(zhuǎn)移對(duì)骨質(zhì)的破壞〔13〕。此外，刺齒鳳尾蕨提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定的體外抗增殖活性〔14，15〕。CyclinD1是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白，其在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮促進(jìn)作用，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白，而p21則發(fā)揮相反的作用。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，當(dāng)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接和極性，獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，提高細(xì)胞的遷移和侵襲能力〔16〕。MMP-2可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。檢測(cè)增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)CyclinD1和MMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低，p21和E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著增加，與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。提示劍葉鳳尾蕨乙醇提取物可有效抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，具有肺癌治療潛力。

LOXL1-AS1位于人類(lèi)染色體15q24.1位置，由10 781個(gè)核苷酸組成。研究顯示氧化應(yīng)激和循環(huán)機(jī)械應(yīng)激分別導(dǎo)致人晶狀體上皮細(xì)胞和神經(jīng)根管內(nèi)皮細(xì)胞中LOXL1-AS1表達(dá)的失調(diào)，與青光眼和剝脫綜合征密切相關(guān)〔17，18〕。隨后在癌癥中逐漸發(fā)現(xiàn)LOXL1-AS1表達(dá)失調(diào)。LOXL1-AS1在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，其高表達(dá)與骨肉瘤患者腫瘤大小、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)及總生存時(shí)間有關(guān)，下調(diào)LOXL1-AS1可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔19〕。LOXL1-AS1高表達(dá)還與膽管癌淋巴結(jié)浸潤(rùn)、原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期及預(yù)后不良有關(guān)，其可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和減少腫瘤凋亡，從而在膽管癌中發(fā)揮致瘤作用〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明劍葉鳳尾蕨乙醇提取物通過(guò)調(diào)控LOXL1-AS1表達(dá)參與對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控。