半乳糖凝集素3在心房顫動(dòng)中主要來(lái)源及作用機(jī)制

謝建 梁珊珊 宋波 秦忠心 彭俊秋 王冰 趙大奎

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院，湖北 隨州 441300)

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱(chēng)房顫)是臨床最常見(jiàn)的心律失常，房顫易導(dǎo)致心力衰竭、心肌梗死等并發(fā)癥〔1〕，給家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，因此闡明房顫的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)房顫的預(yù)防和治療有十分重要的意義。心房纖維化被認(rèn)為是房顫發(fā)生與維持的關(guān)鍵因素〔2〕。心房纖維化主要是心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子參與了心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)〔3〕。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種由Th0細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-23 和IL-21的刺激下分化而成的CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17發(fā)揮促炎作用〔4〕，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要意義〔5〕，而干擾素(IFN)、IL-4、細(xì)胞因子信號(hào)傳送阻抑蛋白3則抑制Th0細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞〔6〕。Th17細(xì)胞在自身免疫中起重要作用，目前證實(shí)Th17輔助細(xì)胞主要執(zhí)行的細(xì)胞因子如IL-1、IL-6及IFN等在心力衰竭、病毒性心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔7，8〕。半乳糖凝集素(Gal)-3是與乙酰-乳糖胺的糖蛋白特異性結(jié)合的凝集素家族成員之一，表達(dá)于多種細(xì)胞，如內(nèi)皮和上皮細(xì)胞、活化巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元和心肌細(xì)胞等〔9〕。有研究顯示高水平的Gal-3與心臟組織中浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積呈正相關(guān)，Gal-3為心肌纖維化的生物標(biāo)志物〔10〕。在急性心肌梗死早期，Gal-3促炎、促纖維化作用在心肌組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用〔11〕。然而，持續(xù)的高水平Gal-3可誘導(dǎo)炎癥和纖維化的過(guò)度激活，導(dǎo)致急性心肌梗死預(yù)后很差〔12〕。房顫是最常見(jiàn)的心律失常，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致心肌組織的炎癥反應(yīng)與房顫發(fā)生相關(guān)，炎癥介質(zhì)可改變心房電生理從而增加房顫的易感性，炎癥還可調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)蛋白和連接蛋白，這些均為干擾心房電傳導(dǎo)的房顫觸發(fā)因素〔13〕。然而，目前關(guān)于Gal-3在房顫中的作用及其主要來(lái)源尚未明確。本研究擬探究Gal-3在房顫動(dòng)物模型中的表達(dá)及分泌來(lái)源和作用機(jī)制，從而為房顫治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克生物有限公司、TGF-β1抗體(貨號(hào)3711)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(貨號(hào)14968)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體(貨號(hào)3852)均購(gòu)自CST公司；PE-抗大鼠CD3 單抗(貨號(hào)A14811)APC-標(biāo)記抗大鼠 CD4 單抗(貨號(hào)A23523)、Gal-3單克隆抗體(貨號(hào)p10212)均購(gòu)自R&D公司；大鼠Gal-3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)YHS3135)購(gòu)自上海煊翎生物有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；引物均由上海杰李生物有限公司合成。一步法反轉(zhuǎn)試劑盒(貨號(hào)p434821)和熒光染料(貨號(hào)P004392)購(gòu)自Thermo。

1.2構(gòu)建SD大鼠房顫模型 按隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性SD大鼠(體重250～300 g)分為對(duì)照組(20只)、房顫組(20只)和房顫干預(yù)組(20只)。實(shí)驗(yàn)時(shí)3組大鼠均用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并氣管插管，連接心電監(jiān)護(hù)。房顫組用食道電極經(jīng)口送入食管比鄰心房處，電極連接電生理儀，設(shè)置電生理儀參數(shù)(電壓20 V，電流4 mA，脈寬6 ms)，通過(guò)電生理儀發(fā)放脈沖波快速起搏心房。每次刺激30 s，間隔5 min待恢復(fù)竇性心律再次刺激，5次/d，通過(guò)心電監(jiān)護(hù)確認(rèn)房顫發(fā)作以證明模型構(gòu)建成功。記錄心臟心電圖的詳細(xì)情況，房顫的發(fā)生時(shí)間以P波消失并出現(xiàn)典型房顫波為標(biāo)志，以恢復(fù)竇性心律作為房顫的終止，期間即為SD大鼠造模后房顫的持續(xù)時(shí)間。房顫干預(yù)組除上述處理外每48 h經(jīng)腹腔注射Gal-3單克隆抗體100 μg，詳細(xì)記錄心電圖。對(duì)照組僅在麻醉后氣管插管和心電監(jiān)護(hù)，不進(jìn)行食道心房刺激。

1.3SD大鼠標(biāo)本采集 ①血液標(biāo)本收集：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、實(shí)驗(yàn)第5天和第10天經(jīng)鼠尾靜脈取血50 μl，立即注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管并充分搖勻，2 000 r/min離心20 min后分離血漿，并將血漿分裝于-80℃低溫冰箱保存。②組織標(biāo)本收集：于實(shí)驗(yàn)第10天將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉后將大鼠前胸壁打開(kāi)，快速取出心臟，置于生理鹽水中去除血液，取50 mg左右心房組織于4%多聚甲醛容器內(nèi)保存，剩余心房組織置于-80℃冰箱保存。

1.4檢測(cè)血漿Gal-3水平 用大鼠Gal-3 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血漿Gal-3蛋白水平。所有血漿樣品檢測(cè)重復(fù)進(jìn)行，以確保變異系數(shù)(CV)低于10%，具體操作步驟根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5RT-PCR檢測(cè)組織標(biāo)本中Gal-3的表達(dá) Trizol提取總 RNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性，分光光度計(jì)測(cè)其純度和濃度。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)心肌組織中Gal-3 的表達(dá)情況。以 β-actin 為內(nèi)參照，分析基因的相對(duì)表達(dá)量。Gal-3：正向引物序列 5′-TCGTAACGTACCAGACG-3′，反向引物序列 5′-CCGTGTACAGTCATGG-3′；β-actin：正向引物序列5′-ACTGATCGCCACCGCAG-3′，反向引物序列5′-ACCACAGTGTGCCGATCTGG-3′。

1.6流式細(xì)胞術(shù)分選心房組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞 取病變區(qū)的心肌組織，眼科剪刀剪碎，用胰酶和膠原酶反復(fù)消化，待組織徹底裂解為單個(gè)細(xì)胞后，用400目的尼龍網(wǎng)去掉上清液中的團(tuán)塊，再用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后制成單細(xì)胞懸液。所得細(xì)胞以 PMA 50 ng/ml，離子霉素1 μg/ml刺激，同時(shí)加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能霉素1 μg/ml，置于37℃、5 %CO2培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞后依次進(jìn)行表面抗原染色(PE-抗大鼠CD3單抗和APC-標(biāo)記抗大鼠CD4單抗，流式細(xì)胞儀上應(yīng)用活細(xì)胞分選術(shù)分選CD4+細(xì)胞和CD3+的其他成熟T淋巴細(xì)胞，運(yùn)用流式軟件FlowJo VX10統(tǒng)計(jì)輔助T淋巴細(xì)胞占所有成熟T淋巴細(xì)胞的比例。將流式分選后的CD3+/CD4+細(xì)胞和CD3+/CD4-的其他成熟T淋巴細(xì)胞收集并培養(yǎng)，校準(zhǔn)細(xì)胞數(shù)量后，培養(yǎng)24 h后ELISA試劑盒檢測(cè)上清中Gal-3蛋白的水平。

1.7心房顫動(dòng)參數(shù) SD大鼠離體心臟的心尖和右心房處分別連接電極，利用Langendorff 離體心臟灌流系統(tǒng)灌注離體SD大鼠心臟，同時(shí)生物電測(cè)量。生物電刺激由固定在心房壁上面的電極發(fā)放，每8個(gè)S1刺激后給予一個(gè)S2刺激，并且不斷縮短S1、S2刺激間期的間隔，最終S2刺激會(huì)落在1個(gè)S1刺激的心房肌有效不應(yīng)期內(nèi)，從而S2刺激不能產(chǎn)生心跳，這個(gè)時(shí)間間隔即心房肌有效不應(yīng)期。檢測(cè)3組心房肌有效不應(yīng)期，同時(shí)統(tǒng)計(jì)3組動(dòng)作電位時(shí)程。

1.8Masson染色 心臟組織切片經(jīng)二甲苯及不同濃度酒精水化至蒸餾水，Masson染色液中染1 h，蘇木素染20 min，自來(lái)水洗，0.5%鹽酸酒精分化30 s，麗春紅-品紅液染色10 min，充分水洗，脫水、透明、封片，運(yùn)用Image軟件分析心肌纖維化水平。

1.9Western印跡 用RIPA裂解心臟組織，組織破碎儀震蕩，12 000 r/min離心20 min，去上清進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，再用6×上樣緩沖液制樣。上樣90 V恒壓電泳，然后以400 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中的抗體4℃過(guò)夜，二抗室溫結(jié)合2 h，加入顯影液曝光顯影，每組復(fù)孔3次。封閉結(jié)束后，根據(jù)目標(biāo)蛋白條帶所在位置剪切條帶，將對(duì)應(yīng)條帶分別在含有0.1%的TGF-β1抗體、α-SMA抗體、MMP-9抗體、tubulin抗體的TBST溶液中4℃敷育過(guò)夜，然后在TBST溶液中洗膜，在對(duì)應(yīng)二抗溶液中室溫敷育2 h，TBST洗膜后加入顯影液曝光顯影。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組Gal-3水平比較 房顫組血漿中Gal-3水平〔(4.23±0.31)ng/L〕顯著高于對(duì)照組〔(1.27±0.19)ng/L,P<0.05〕；房顫組心房組織中Gal-3 mRNA水平(5.46±0.78)顯著高于對(duì)照組(1.04±0.08，P<0.05)。

2.2兩組CD3+/CD4+占成熟T淋巴細(xì)胞的比例比較 房顫組CD3+/CD4+占成熟T淋巴細(xì)胞的比例〔(50.12±4.56)%〕顯著高于對(duì)照組〔(13.27±1.73)%,P=0.007〕。見(jiàn)圖1。

2.3兩組T淋巴細(xì)胞亞群中Gal-3水平比較 對(duì)照組CD3+/CD4-的成熟T淋巴細(xì)胞上清中Gal-3水平〔(0.11±0.03)ng/L〕顯著低于房顫組〔(0.19±0.06)ng/L,P<0.05〕;對(duì)照組CD3+/CD4+的成熟T淋巴細(xì)胞上清中Gal-3水平〔(0.21±0.03)ng/L〕顯著低于房顫組〔(0.39±0.04)ng/L，P<0.05〕；且兩組CD3+/CD4+的成熟T淋巴細(xì)胞上清中Gal-3水平顯著高于CD3+/CD4-的成熟T淋巴細(xì)胞上清中Gal-3水平(均P<0.05)。表明房顫時(shí)血清中高水平的Gal-3主要來(lái)源于CD3+/CD4+細(xì)胞。

2.43組心電圖基本參數(shù)比較 對(duì)照組無(wú)房顫發(fā)生；在刺激期房顫組均發(fā)生房顫，表明房顫模型構(gòu)建成功；房顫干預(yù)組僅16只發(fā)生房顫，房顫發(fā)生率80%。房顫組平均心率、房性期前收縮個(gè)數(shù)、房性二聯(lián)律個(gè)數(shù)、房性三聯(lián)律個(gè)數(shù)、房顫持續(xù)時(shí)間均顯著高于對(duì)照組，而給予Gal-3抗體干預(yù)后上述指標(biāo)均顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.53組心房不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)程水平比較 房顫組心房不應(yīng)期及動(dòng)作電位時(shí)程均顯著低于對(duì)照組，而給予Gal-3抗體干預(yù)后上述指標(biāo)均顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組心房不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)程比較

2.63組心房組織間質(zhì)纖維化 房顫組心房組織間質(zhì)纖維化水平〔(4.08±0.59)%〕顯著高于對(duì)照組〔(1.02±0.05)%〕，而給予Gal-3抗體干預(yù)后心房組織間質(zhì)纖維化水平顯著降低〔(2.12±0.17)%,P<0.05〕。見(jiàn)圖2。

圖2 3組心房組織間質(zhì)纖維化(Masson,×200)

2.73組心房組織纖維化相關(guān)蛋白水平比較 房顫組TGF-β1、α-SMA、MMP-9水平均顯著高于對(duì)照組，而給予Gal-3抗體干預(yù)后上述指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表3。

圖3 3組組織纖維化相關(guān)蛋白水平

表3 3組心房組織纖維化相關(guān)蛋白水平比較

3 討 論

Gal-3可通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞活化，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放及促進(jìn)中性粒細(xì)胞和層黏連蛋白及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附促進(jìn)炎癥反應(yīng)，Gal-3可促進(jìn)T細(xì)胞的激活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子和化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子(CAM)-1，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生〔14〕。Gal-3是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，可通過(guò)促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來(lái)放大炎癥反應(yīng)，并參與了心房纖維化〔15〕。

研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康志愿者，心力衰竭患者Gal-3、IFN-γ、IL-17A和TGF-β水平升高，并與臨床嚴(yán)重程度相關(guān)，Gal-3是一種高特異性的診斷心力衰竭和判斷臨床嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物〔16，17〕。研究表明高水平的Gal-3與心力衰竭患者的死亡率有顯著的相關(guān)性〔18〕，房顫是心房電重構(gòu)的結(jié)果，而心肌纖維化是導(dǎo)致心房電重構(gòu)、心臟電活動(dòng)的發(fā)生和傳導(dǎo)異常，促進(jìn)房顫發(fā)生的重要原因〔19，20〕。本研究結(jié)果提示抗炎治療可能是房顫的治療途徑之一。

初始CD4+T 細(xì)胞接受抗原刺激后，在不同的條件下可分化成不同亞型的T細(xì)胞，執(zhí)行不同的功能。其分化方向受抗原的性質(zhì)、局部環(huán)境中的激素及細(xì)胞因子等多種因素調(diào)控〔21〕，其中細(xì)胞因子的種類(lèi)和細(xì)胞因子之間的平衡對(duì)T淋巴細(xì)胞的分化有重要的調(diào)節(jié)作用〔22〕。許多轉(zhuǎn)錄因子如Foxp3可特異性調(diào)控Th17細(xì)胞的活化〔23，24〕，因此通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及加入炎癥因子中和抗體抑制T 細(xì)胞的增殖活化，是改善房顫的重要途徑。

研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞能抑制T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，明顯促進(jìn)TGF-β的產(chǎn)生〔25〕，當(dāng)加入抗TGF-β 中和性抗體時(shí)，可抑制心房組織纖維化的發(fā)生〔26〕。本研究結(jié)果表明，加入抗Gal-3中和性抗體可顯著改善心房組織纖維化。

綜上，大鼠房顫模型中心房組織的Gal-3基因水平和蛋白質(zhì)水平均顯著升高，且Th17是房顫時(shí)高水平Gal-3的主要來(lái)源，Gal-3與房顫時(shí)炎癥和纖維化的發(fā)生相關(guān)。Gal-3是一種有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的前炎性細(xì)胞因子，能促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎性因子，在心房組織重塑及心房間質(zhì)纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)房顫發(fā)生的重要靶點(diǎn)。