miR-187在骨質(zhì)疏松性骨折患者血清中表達及其作用機制

張濤 楊扉扉 王藜篥 黃華 張松 曹永飛

(貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽 550002)

骨密度(BMD)降低是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因〔1〕。骨質(zhì)疏松與骨代謝失衡密切相關(guān)，成骨細胞造骨量與破骨細胞吸收量處于動態(tài)平衡，若破骨細胞增加可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔2，3〕。因而深入探究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制并抑制破骨細胞活性可為該疾病的防治提供新方向。既往研究表明微小RNA(miRNA)在破骨細胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，而早期預(yù)測骨質(zhì)疏松骨折風(fēng)險有利于該疾病的預(yù)防與治療〔4，5〕。微小RNA-187(miR-187)在骨質(zhì)疏松性骨折患者中低表達，miR-187過表達可促進成骨前體細胞增殖并抑制其分化〔6〕。有報道指出Notch信號通路與破骨細胞增殖及凋亡有關(guān)〔7〕。但miR-187是否通過調(diào)控Notch信號通路而影響破骨細胞增殖及凋亡尚未可知。本研究主要探討miR-187與Notch信號通路的相關(guān)性及其對骨質(zhì)疏松的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2017年5月至2018年6月貴州省骨科醫(yī)院收治的60例骨質(zhì)疏松性骨折患者作為實驗組，50例骨折但未發(fā)生骨質(zhì)疏松患者作為對照組，實驗組與對照組年齡、性別與體重指數(shù)(BMI)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。同時應(yīng)用雙能X線骨密度儀(上海企晟醫(yī)療器械有限公司)檢測兩組患者腰椎正位總體L1～4 BMD。實驗組患者均符合骨質(zhì)疏松性椎體骨折診斷標準〔8〕。納入標準：患者均經(jīng)影像學(xué)診斷為椎體骨折。排除標準：炎癥或占位性病變等引起的病理性骨折；既往椎體受傷病史；患有椎管狹窄及爆裂性椎體骨折；合并心腦肝等重要臟器損傷患者；藥物引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松患者；強直性脊柱炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；近期服用影響骨代謝藥物者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。兩組均于入組后次日清晨抽取空腹外周靜脈血2 ml，4℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，吸取血清置于離心管內(nèi)，放入-20℃超低溫冰箱保存待測。

表1 兩組臨床資料對比

1.2大鼠實驗

1.2.1主要試劑 10只清潔級SD大鼠，體重70～120 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2016-0008。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄及實時定量 PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(MTT)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司；兔抗鼠細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax)多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Notch1、Jagged1、Delta樣蛋白(DLL)3、Notch2抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；miR-187模擬物(mimics)及陰性對照均購自上海吉瑪公司。

1.2.2骨質(zhì)疏松大鼠模型建立 取SD大鼠，禁食12 h，將0.5 g的阿托品注射入大鼠肌肉內(nèi)，使用水合氯醛(體積分數(shù)3.6%)麻醉大鼠，消毒與鋪巾，從大鼠背部正中作為切口并取出肋緣下側(cè)雙側(cè)卵巢，縫合切口，使用無菌紗布與油紗雙層敷料覆蓋創(chuàng)傷面，包扎后給予抗生素，目的是預(yù)防感染，待大鼠清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，檢測大鼠血、尿與骨骼參數(shù)等判斷造模是否成功〔9〕。

1.2.3大鼠原代破骨細胞分離及培養(yǎng) 10只大鼠均造模成功，采用頸椎脫位法處死大鼠，乙醇消毒后取大鼠兩側(cè)股骨、脛骨及其周圍軟組織，去除兩端骨骺，骨髓腔暴露，采用DMEM培養(yǎng)基(50 ml)沖洗骨髓腔直至其骨面變白，白色沉淀物即為破骨細胞樣細胞團，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，輕輕吹打混勻，用200目細胞篩過濾細胞懸液，取過濾后的細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，輕輕吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，更換培養(yǎng)液，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)〔10〕。破骨細胞培養(yǎng)于含有10% FBS、青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到80%時進行傳代培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定傳代3～5代后，取對數(shù)期破骨細胞進行后續(xù)研究。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染及實驗分組 取對數(shù)期破骨細胞，參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-187 mimics、miR-con轉(zhuǎn)染至破骨細胞，分別命名為miR-187組、miR-con組。轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%FBS的DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞。同時將不轉(zhuǎn)染任何基因且正常培養(yǎng)的破骨細胞作為NC組。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-187相對表達量 取出凍存血清及各組破骨細胞，采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA。miR-187正向引物5′-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3′，反向引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6為內(nèi)參，正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。嚴格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。miR-187以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-187相對表達量。

1.2.6MTT檢測細胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后各組破骨細胞，接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時每孔加入20 μl MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，勻速振蕩10 min，應(yīng)用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值(OD)。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組破骨細胞，0.25%胰酶消化，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×108個/L，預(yù)冷PBS洗滌，加入10 μl濃度為20 mg/L的Annexin V-FITC與5 μl濃度為50 mg/L的PI，室溫避光孵育30 min，置于FACS Calibur流式細胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡。

1.2.8Western印跡檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax及Notch信號通路相關(guān)蛋白表達 收集各組破骨細胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解細胞，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上層清液(蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)90 min分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、Notch1、Jagged1、DLL3、Notch2一抗，4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜，二抗稀釋液孵育1 h，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，單因素方差分析、Pearson分析；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-187對骨質(zhì)疏松性骨折的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1兩組BMD對比 實驗組BMD為(0.56±0.03)g/cm2，對照組BMD為(0.78±0.12)g/cm2，實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組血清miR-187相對表達量比較 實驗組血清miR-187相對表達量明顯低于對照組(1.46±0.51 vs 2.20±0.69;P<0.001)。

2.3血清miR-187與BMD的相關(guān)性 骨質(zhì)疏松性骨折患者血清miR-187與BMD呈正相關(guān)(r=0.357，P<0.05)，見圖1。

圖1 血清miR-187與BMD的相關(guān)性

2.4血清miR-187對骨質(zhì)疏松性骨折的臨床預(yù)測價值 如圖2所示，血清miR-187用于預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的ROC曲線下面積(AUC)為0.856，95%CI為0.786～0.926，最佳界值為0.583，敏感度為0.700，特異度為0.883。

圖2 血清miR-187預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的ROC曲線

2.5miR-187過表達對破骨細胞增殖的影響 48、72 h時miR-187組破骨細胞的相對吸光度值較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，miR-187組CyclinD1 表達量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，p21蛋白相對表達量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)。表明miR-187過表達可抑制破骨細胞增殖。見表2、圖3。

圖3 miR-187過表達對破骨細胞增相關(guān)蛋白表達的影響

2.6miR-187過表達對破骨細胞凋亡的影響 miR-187組破骨細胞凋亡率較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)，miR-187組Bax表達量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)，Bcl-2 表達量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，表明miR-187過表達可促進破骨細胞凋亡。見表2、圖4、圖5。

圖4 miR-187過表達對破骨細胞凋亡的影響

圖5 miR-187過表達對破骨細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.7miR-187過表達對破骨細胞Notch信號通路的影響 miR-187組Notch1、Jagged1、DLL3表達量較NC組、miR-con組顯著增加(P<0.05)；Notch2 表達量較NC組、miR-con組顯著降低(P<0.05)，表明miR-187過表達可激活Notch信號通路。見圖6、表3。

圖6 miR-187過表達對破骨細胞Notch信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

表3 miR-187過表達對破骨細胞Notch信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

骨吸收量高于骨形成是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本原因，近年來，研究表明miRNA在成骨細胞或破骨細胞活性及分化過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。miR-187-3p過表達可抑制IL-1β等炎癥因子的釋放從而減輕小鼠脊髓缺血再灌注引起的疼痛超敏反應(yīng)〔12〕。研究表明miR-187表達下調(diào)可促進氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細胞凋亡〔13〕。相關(guān)報道指出miR-187表達下調(diào)可促進牛皮癬中角質(zhì)形成細胞增殖〔14〕。本研究結(jié)果說明隨著骨質(zhì)疏松性骨折患者BMD或骨代謝能力的降低，miR-187的表達水平顯著降低。提示miR-187表達水平降低可能促進骨質(zhì)疏松的發(fā)生及發(fā)展。本研究ROC曲線分析提示血清miR-187可能作為臨床診斷骨質(zhì)疏松患者是否發(fā)生骨折的生物學(xué)指標。但miR-187在骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生過程中的調(diào)控機制尚未闡明。研究表明破骨細胞由多個單核細胞融合生成，細胞凋亡、細胞周期在破骨細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，CyclinD1與p21是調(diào)控細胞周期的重要基因，p21可抑制細胞周期停滯于G0/G1期，CyclinD1可促進細胞周期由G1期進展為S期，促進細胞增殖〔15〕。本研究顯示miR-187過表達后破骨細胞增殖能力顯著降低，提示miR-187過表達可能通過促使細胞周期停滯于G0/G1期從而抑制細胞增殖。相關(guān)報道指出破骨細胞凋亡與Bcl-2、Bax基因表達密切相關(guān)，Bcl-2可抑制細胞凋亡，Bax可促進細胞凋亡，Bax表達水平升高可拮抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用〔16〕。本研究結(jié)果顯示miR-187過表達后破骨細胞凋亡率顯著升高，提示miR-187過表達可通過上調(diào)Bax的表達及下調(diào)Bcl-2的表達從而誘導(dǎo)破骨細胞凋亡。

Notch信號通路激活后可促進成骨細胞分化及抑制破骨細胞增殖活性從而防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生〔17〕。Notch1是Notch信號通路中重要蛋白，研究表明Notch1的表達水平升高可促進Jagged1、DLL3的表達量升高，同時破骨細胞形成數(shù)量明顯減少〔18〕。相關(guān)報道指出Notch信號通路由4個受體與5個配體組成，其中Notch2、Notch1、Jagged1、DLL3在人類間充質(zhì)干細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，同時Notch2表達量與破骨細胞增殖能力呈正相關(guān)，而Notch1、Jagged1、DLL3表達量與破骨細胞增殖能力呈負相關(guān)〔19，20〕。本研究結(jié)果提示miR-187可能通過增強Notch1信號通路同時抑制Notch2信號通路從而抑制破骨細胞增殖、分化，促進細胞凋亡。綜上所述，miR-187可抑制破骨細胞增殖，促進破骨細胞凋亡，其作用機制可能是通過激活Notch1信號通路，抑制Notch2信號通路從而抑制破骨細胞增殖分化，誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，減少破骨細胞存活，可為揭示骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制奠定理論基礎(chǔ)，可為骨質(zhì)疏松的治療提供新方向。