YAP1、miR-31與老年卵巢癌患者微血管密度的關(guān)系

江娜 王秀虹 程欣

(咸寧市中心醫(yī)院婦科，湖北 咸寧 437100)

卵巢上皮癌多發(fā)生在40歲以上〔1,2〕，癥狀包括腹脹、骨盆疼痛、腹部腫脹和食欲不振等，因此能夠及時評估患者當(dāng)時病情程度尤為重要〔3〕。研究表明〔4〕，卵巢癌可導(dǎo)致異常細(xì)胞有能力侵入或擴(kuò)散到身體的其他部位且發(fā)生重要病理改變，Yes相關(guān)蛋白(YAP)1、miR-31及微血管密度(MVD)均參與了這個過程。研究指出，YAP1、miR-31及MVD與卵巢癌有關(guān)系，可以作為卵巢癌病理改變的有效觀察指標(biāo)〔5〕。吳東雅等〔6〕研究指出，YAP1基因不僅可以參與維持器官的大小，還可作為癌基因與人類腫瘤形成密切相關(guān)。徐志宏等〔7〕研究提出，miR-31是卵巢癌的獨立危險因素，但在國內(nèi)與此相關(guān)的研究較少。Esencan等〔8〕研究提出，血管生成可通過灌注效應(yīng)及轉(zhuǎn)移效應(yīng)，可促進(jìn)腫瘤的生長及浸潤、轉(zhuǎn)移，其中包括卵巢癌在內(nèi)的實體腫瘤普遍存在的病理現(xiàn)象。本文擬分析YAP1、miR-31與老年卵巢癌患者M(jìn)VD的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年1月至2021年1月在咸寧市中心醫(yī)院治療的老年卵巢癌患者105例作為卵巢癌組，選取行健康體檢的63例作為卵巢良性病變組。卵巢癌組年齡60～73歲，平均(63.17±6.18)歲，病程1.0～3.5年，平均(2.13±1.19)，癥狀：腸道壓迫感39例、腹脹32例、骨痛34例，流產(chǎn)史5例，月經(jīng)紊亂史48例，胃腸脹氣史52例；根據(jù)患者檢查結(jié)果及依據(jù)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移部位、有無發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移將其分為早期、中期、晚期3組，分組參考《2017年第4版NCCN卵巢癌臨床實踐指南》〔9〕中對其嚴(yán)重程度的評判標(biāo)準(zhǔn)。卵巢良性病變組年齡60～72歲，平均(62.70±5.70)歲，癥狀：腸道壓迫感25例、腹脹27例、骨痛11例，流產(chǎn)史6例，月經(jīng)紊亂史20例，胃腸脹氣史37例；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后，所有研究對象及家屬簽署知情同意書，兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：卵巢良性病變組存在腹部壓迫痛、小便痛；卵巢癌組符合《2020NCCN卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實踐指南(第1版)》〔10〕中對卵巢癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且患者均存在腹脹、惡心、嘔吐等消化道等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：腎臟功能嚴(yán)重受損或心力衰竭、陰道流血不止、存在其他腹部疾病、嚴(yán)重感染性疾病者、智力障礙、合并惡性腫瘤、凝血功能障礙、病例重復(fù)患者、依從性差。

1.2主要設(shè)備 試劑及化學(xué)物品均為國產(chǎn)分析純。

1.3YAP1、miR-31檢測 取患者卵巢組織后置入10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，在取出樣本中的組織采用免疫組化檢測YAP1、miR-31表達(dá)水平，兔抗人YAP1、miR-31、MVD、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體、免疫組化檢測，試劑盒分別購自武漢菲恩生物科技有限公司、上海雅吉生物科技有限公司、武漢維克賽思科技有限公司，胞膜及胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色的顆粒表示為陽性細(xì)胞，每張切片在高倍鏡下選出5個視野，最后加入蘇木素給予復(fù)染，鹽酸乙醇分化后，梯度乙醇進(jìn)行脫水，用二甲苯?jīng)_洗片至透明后進(jìn)行中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況；根據(jù)染色細(xì)胞百分比和染色程度進(jìn)行評估,根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評估：陽性細(xì)胞數(shù)>5%計為陽性例數(shù)，計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為0%～5%(-)，6%～20%(+)，21%～50%()，51%～100%()。

1.4YAP1、miR-31、MVD水平檢測 采用實時熒光定量PCR測定YAP1、miR-31、MVD表達(dá)量，利用PCR試劑盒合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄：14 μl模板RNA、2 μl Enzyme mix，4 μl 5×RT緩沖液，補(bǔ)至20 μl，在PCR檢測儀上42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后將所合成的cDNA放置于溫度為-20℃環(huán)境下進(jìn)行保存。將血液放在不加抗凝劑的試管中，血液凝固將血清吸出。隨后將血液放在乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中后將血漿吸出。采集完成后馬上進(jìn)行檢測，將抽取血放在取血器后加緩沖液，混勻61 s后將試劑卡滴3滴混合液，插入試劑卡等待185 s，即為YAP1、miR-31、MVD檢測結(jié)果。

1.5VEGF水平檢測 抽取患者清晨空腹靜脈血4 ml，離心5 cm、3 000 r/min離心10 min，分離出的上層血清，在-45℃環(huán)境下保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測VEGF水平；制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔中加入已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，在35℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用洗滌液將反應(yīng)板洗3次后，加入1∶100倍稀釋后的抗體工作液100 μl/孔，放于35℃環(huán)境中濕育45 min；在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，置于35℃環(huán)境45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液用來終止反應(yīng)，在450 nm波長測定吸光度，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算VEGF水平(顏色反應(yīng)深淺與VEGF呈正比)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件行方差齊性檢驗、t檢驗、Logistic分析及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組YAP1、miR-31表達(dá)比較 與卵巢良性病變組相比，卵巢癌組YAP1表達(dá)量顯著升高，miR-31表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖1,表1。

表1 兩組YAP1、miR-31表達(dá)比較

2.2兩組MVD、VEGF水平比較 與卵巢良性病變組相比，卵巢癌組MVD、VEGF水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組MVD、VEGF水平比較

2.3發(fā)生中晚期卵巢癌影響因素的多元Logistic回歸分析 將發(fā)生中晚期癌變(早期=0，中晚期=1)作為因變量，將YAP1、miR-31及MVD作為自變量，納入二分類多因素 Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，YAP1、miR-31及MVD為影響中晚卵巢癌發(fā)生的因素(P<0.05)，見表3。

表3 發(fā)生中晚期卵巢癌影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4YAP1、miR-31與MVD相關(guān)性 YAP1與miR-31呈負(fù)相關(guān)(r=-0.028，P=0.008)，與MVD呈正相關(guān)(r=0.010，P=0.001)；miR-31與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.017，P=0.003)，見圖2。

圖2 YAP1、miR-31與MVD的相關(guān)性

3 討 論

卵巢癌是來源于卵巢與輸卵管的惡性腫瘤,隨著疾病進(jìn)展,也會轉(zhuǎn)移到身體其他部位，是目前所認(rèn)為多種危險因素綜合作用的結(jié)果，對于平均風(fēng)險的女性，不建議進(jìn)行篩查，因為證據(jù)不支持減少死亡，且高誤報率可能導(dǎo)致不必要的手術(shù)，伴隨自身的風(fēng)險〔11〕。臨床上，通過對卵巢癌患者進(jìn)行病理測定，可判斷其疾病嚴(yán)重程度。如何判斷卵巢癌患者疾病嚴(yán)重程度，應(yīng)作為早期診斷卵巢癌的研究策略。

卵巢癌是一種易轉(zhuǎn)移、侵襲能力強(qiáng)的婦科惡性腫瘤，且復(fù)發(fā)率及死亡率極高。因此發(fā)現(xiàn)卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程有關(guān)鍵作用〔12〕。YAP1可作為癌基因與人類腫瘤形成的重要指標(biāo)，在研究中通過對小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)〔13〕，乳腺癌腫瘤組織中存在具有潛在促癌作用的YAP1基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并有效抑制細(xì)胞凋亡。在生理狀態(tài)下，YAP1可作為Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的靶因子，可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及組織器官的正常大小。有研究表明〔14〕，YAP1在一些腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，如胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達(dá)水平異常增高，提示此指標(biāo)活性增強(qiáng)，其與腫瘤發(fā)生及發(fā)展有一定關(guān)系。另有研究表明〔15〕，YAP1過度表達(dá)可使肝癌患者肝臟顯著增大，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。盡管YAP1在腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用，但在卵巢癌的表達(dá)水平及臨床特征之間的關(guān)系鮮有報道，本研究結(jié)果推測YAP1卵巢癌發(fā)生及發(fā)展中可能發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)YAP1在正常水平下可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及組織器官的正常大小且在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程有關(guān)鍵作用，但目前有關(guān)YAP1在卵巢癌中作用的研究尚少，故需進(jìn)一步探究。

MiRNA在卵巢癌領(lǐng)域的研究中備受關(guān)注，它是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的腸胃21～26個核苷酸的RNA，在人體內(nèi)發(fā)揮很多生物學(xué)作用，且具有預(yù)后評價、早期診斷的指導(dǎo)價值，可能成為卵巢癌新的治療靶點，具有極高的生物應(yīng)用價值〔16,17〕。在已發(fā)現(xiàn)的miRNAs中，miR-31是調(diào)節(jié)惡性腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)鍵基因，有研究報道〔18〕，在結(jié)腸癌細(xì)胞體系中，miR-31可通過MTI等靶基因增加惡性腫瘤細(xì)胞遷移，通過抑制miR-31可快速增強(qiáng)SW480細(xì)胞的遷移。另有研究表示〔19〕，在乳腺癌中miRNA是一種抑癌基因，相反在結(jié)腸癌中miR-31的表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，因此認(rèn)為miR-31在不同腫瘤中截然不同的表達(dá)現(xiàn)象在很多實驗中都得到了相應(yīng)印證，然而，miR-31在卵巢癌中的臨床意義及預(yù)后的價值尚未研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-31可能是卵巢癌的一個新診斷及預(yù)后標(biāo)志物。

卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展依賴于新生血管的生成，腫瘤細(xì)胞通過合成及分泌血管生成因子，可調(diào)節(jié)腫瘤組織的血管生成〔20〕。VEGF、MVD是腫瘤血管發(fā)生過程中的主要正性調(diào)控因子，可促進(jìn)血管生成并參與腫瘤的發(fā)展過程，VEGF、MVD可通過作用于特異受體而發(fā)揮相應(yīng)性生物學(xué)作用。VEGF、MVD可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體誘導(dǎo)血管的形成，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，還可通過作用于腫瘤細(xì)胞上的受體，直接促進(jìn)腫瘤生長。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，提示VEGF、MVD可參與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展，且與卵巢癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)〔21〕，VEGF、MVD通過與其相應(yīng)受體結(jié)合等多種機(jī)制參與其中，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長、血管形成等，MVD可作為預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移潛能及惡性腫瘤生成的指標(biāo)。本文結(jié)果提示YAP1、miR-31、MVD可能共同參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，臨床可根據(jù)其高低評估病情嚴(yán)重程度。以上結(jié)果說明YAP1、MVD的升高及miR-31的降低可加重疾病與腫瘤惡化程度。

綜上，YAP1、miR-31、MVD在卵巢癌中具有一定相關(guān)性，其水平的異常表達(dá)可加重疾病與腫瘤惡化程度，可用于卵巢癌患者的臨床診斷。