LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中的表達及臨床意義

楊大偉 黃慶 周連吉 歐麗娜 吳標良

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科，廣西 百色 533000)

2型糖尿病(T2DM)發(fā)病機制至今仍未完全明確〔1～4〕。近年來隨著人類基因組學研究技術的發(fā)展，長鏈非編碼RNA(LncRNA)逐漸進入人們的視野并引起廣大科研人員的關注。越來越多的研究表明，LncRNA正在成為糖尿病發(fā)病環(huán)節(jié)中的積極參與者〔5,6〕。LncRNA肺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1是一種經典的，廣為研究者研究的LncRNA。MALAT1廣泛表達于多種組織中，最初的研究主要集中于它與腫瘤的關系方面〔7,8〕。但后來的研究表明，LncRNA MALAT1與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥之間的關系密切〔9〕。中國的一項研究中共收集了50例患有妊娠糖尿病的患者及47名健康孕婦，發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病患者血清中LncRNA MALAT1水平升高〔10〕。Liu等〔11〕在研究中使用sh-MALAT1沉默了人臍靜脈內皮細胞中的MALAT1表達，發(fā)現(xiàn)MALAT1沉默后，抵抗素(resistin),血管緊張素(Ang)Ⅱ,腫瘤壞死因子(TNF)-α,白細胞介素(IL)-6,可溶性細胞間黏附分子(sICAM)-1表達水平下降，胰島素抵抗減輕，同時在小鼠模型中，觀察到運動可以下調MALAT1水平，減少了胰島素抵抗的發(fā)生。Yan等〔12〕在研究中發(fā)現(xiàn)高血糖能夠引起視網(wǎng)膜內皮細胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中MALAT1 表達增加；沉默 MALAT1表達后，能夠顯著緩解糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管化、血管的滲漏和視網(wǎng)膜炎癥。在糖尿病大鼠心肌細胞中，LncRNA MALAT1的下調，可以保護心肌細胞，并改善心功能〔13〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在糖尿病腎病小鼠腎皮質中高表達，可以使β-catenin發(fā)生易位到細胞核上，同時會增強絲氨酸/精氨酸剪接因子1的表達，從而引起腎臟足細胞的損傷。而早期沉默MALAT1后足細胞功能得到了部分恢復〔14〕。

盡管以上研究說明了LncRNA MALAT1與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，但目前仍缺乏LncRNA MALAT1在T2DM人群表達情況的研究。本研究擬探討 LncRNA MALAT1 在T2DM人群中的表達及臨床意義。

1 材料和方法

1.1一般資料 共收集2017年1～7月在廣西壯族自治區(qū)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院部就診的患者94例，其中糖尿病患者69例，同時選擇正常健康體檢者25例作為對照組。糖尿病組男44例，女25例，平均年齡(55.54±11.93)歲；體重指數(shù)(BMI)為(24.03±11.17)kg/m2，有吸煙史11例；對照組男14例，女11例，平均年齡(52.12±12.82)歲，BMI為(24.63±4.80)kg/m2，有吸煙史5例。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。糖尿病組入組條件：①年齡35～65歲。②排除腫瘤、感染、傳染性疾病等其他重大疾病。③符合2017年中國T2DM防治指南中T2DM的診斷標準〔15〕。對照組入組條件符合上述1、2條，但經糖耐量實驗不符合糖尿病診斷者。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者均知情同意。

1.2一般資料與臨床指標收集 所有患者于入院時進行體格檢查，收集體重、身高、血壓、心率等基本資料，并計算BMI?？崭寡?FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂等生化指標使用邁瑞B(yǎng)S-2000M(邁瑞，中國深圳)全自動生化儀進行檢測，胰島素、皮質醇等使用全自動化學發(fā)光測定儀A2000(安圖實驗儀器有限公司，中國鄭州)進行檢測，所有檢測由右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)受過專業(yè)培訓的技術人員進行?？诜咸烟悄土吭囼?OGTT)于次日8點在空腹狀態(tài)下開始進行，將75 g無水葡萄糖溶入200～300 ml溫開水中，于5 min內飲完，隨即開始采血，并立即送檢標本。使用胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)來評估患者胰島素抵抗的情況，計算公式為HOMA-IR=FPG×空腹胰島素/22.5。所有單位換算為國際標準單位。

1.3RT-PCR 所有患者于清晨8時開始采血，抽取5 ml靜脈血，加入9 ml紅細胞裂解液，混勻后于4℃下2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗，提取好的白細胞于-80℃下進行保存。使用Trizol 試劑盒(普飛，中國上海)抽提白細胞中的總RNA，然后使用Promega M-MLV 試劑盒(銳博生物，中國廣州)進行反轉錄，反轉錄引物購自中國銳博生物有限責任公司。以上操作均嚴格按照試劑說明書進行操作。

PCR分析使用SYBR綠色試劑盒(天根生物，北京)。PCR條件：95℃ 15 min；(95℃ 10 s；60℃ 20 s )× 40 個循環(huán)。PCR使用溶解曲線評估。每個樣本設置3個平行樣，取平均值。以 2-ΔΔCt值表示LncRNA MALAT1的表達水平，ΔΔCt =(CTMALAT1-CTGADPH)DM-(CTMALAT1-CTGADPH)con。引物序列：MALAT1：上游5′-CAGACCACCACAGGTTTACAG-3′、下游5′-AGACCATCCCAAAATGCTTCA-3′，GADPH：上游 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、非參數(shù)檢驗、Spearman相關分析、二元Logistic 回歸模型分析。受試者工作特征(ROC)曲線及曲線下面積(AUC)用于評價診斷指標的診斷效能。

2 結 果

2.1兩組臨床資料對比 糖尿病組 FPG、超氧化物歧化酶(SOD)、HbA1C均顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2LncRNA MALAT1在兩組表達 糖尿病組血清白細胞中LncRNA MALAT1表達水平(2.40±1.01)較對照組(1.04±0.28)明顯升高(t=-6.587,P<0.001)。

2.3二元回歸分析LncRNA MALAT1與T2DM發(fā)病之間的關系 使用二元Logistic回歸分析對T2DM患者的發(fā)病的影響因素進行評估。結果顯示LncRNA MALAT1(P<0.001，OR=11.667，95%CI：3.181～42.792)及SOD(P=0.018，OR=0.958，95%CI：0.925～0.993)是T2DM發(fā)病的影響因素。

2.4LncRNA MALAT1表達與OGTT實驗中胰島素分泌之間的相關分析 LncRNA MALAT1表達與SOD(r=-0.26，P=0.01)、HbA1c(r=0.35,P=0.001)、OGTT實驗中胰島素分泌(60 min)(r=0.35,P<0.001)及血糖(60、120、180 min)(r=0.35、0.40、0.39，均P<0.001)存在相關性，其余指標未見明顯相關性。

2.5ROC曲線分析LncRNA MALAT1對T2DM的預測意義 AUC為0.807(95%CI： 0.708～0.906,P<0.001)，敏感度為 78.3%，特異度為 84.0%。見圖1?？芍?，LncRNA MALAT1的表達對T2DM有一定的預測價值。

圖1 ROC分析LncRNA MALAT1作為診斷T2DM血清標志物的生物潛能

3 討 論

LncRNA被認為與細胞的分化、增殖、代謝及多種生命活動相關，參與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展〔16～19〕。目前有研究指出多種LncRNA與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有著十分密切的關系，包括H19〔20〕、MEG3〔21〕、uc.322〔22〕等。

本研究與Zhang等〔10〕研究結果是一致的，在妊娠期糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1較正常孕婦升高。同時本研究說明LncRNA MALAT1對糖尿病患者的血糖控制是有影響的，同時也表明LncRNA MALAT1表達升高會導致糖尿病患者的血糖控制差而加速并發(fā)癥的發(fā)生。這與近年來的研究指明LncRNA MALAT1參與糖尿病腎病〔23〕、糖尿病視網(wǎng)膜病變〔24〕的發(fā)病相符合。

本研究結果表明了LncRNA MALAT1可能影響了機體對高血糖的反饋調節(jié)。機體對于高血糖的正確反饋是分泌更多的胰島素以降低過高的血糖，LncRNA MALAT1可能通過抑制胰島素對高血糖的主動分泌而影響了血糖的升高。在Feng等〔25〕的研究中，LncRNA MALAT1可以通過下調miR124的表達抑制CDK4/E2F1信號通路來抑制乳腺癌的增殖，而CDK4/E2F1通路是影響胰島素分泌的重要通路。這是否驗證了我們的猜測，當然，這需要更進一步的研究去證明它們之間的聯(lián)系。

SOD是人體內最重要的抗氧化劑，而氧化應激目前已被認為是糖尿病發(fā)病及諸多并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因〔20〕。Gong等〔26〕研究顯示，LncRNA MALAT1在糖尿病性白內障患者中同樣與SOD的水平呈負性相關，并推測其可能通過p38MAPK信號通路來誘導了氧化應激的產生。Chen等〔27〕的研究發(fā)現(xiàn)在下調了LncRNA MALAT1的大鼠中，活性氧(ROS)明顯下降。這些都表明LncRNA MALAT1可以誘導機體氧化應激反應。但是，LncRNA MALAT1誘導氧化應激參與T2DM發(fā)病的具體分子機制仍需要進一步探討。

綜上，LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中高表達，可作為其診斷的潛在標志物，其可能的機制不明，但或與氧化應激有關。