基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制

吳智春 于華蕓 宋曉彤 王媛 王華 王志宏

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心；3山東中醫(yī)藥 大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科)

高血壓是中國面臨的重要公共衛(wèi)生問題，高血壓左室肥大是心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與心律失常、猝死和心力衰竭密切相關(guān)〔1〕。滋腎活絡(luò)方為改善高血壓左室肥大的臨床效方，臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)可一定程度上逆轉(zhuǎn)左室肥厚〔2,3〕，但主要活性成分、靶點(diǎn)仍不清楚，且缺乏整體分析其藥理作用機(jī)制的研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，系統(tǒng)研究滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的主要活性成分、作用靶標(biāo)及相關(guān)通路，闡釋“藥物-靶點(diǎn)-通路”之間的相互作用，以期系統(tǒng)、全面闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1滋腎活絡(luò)方化學(xué)成分與靶點(diǎn)的獲取 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別以玄參、牛膝、黃連、牡丹皮、益母草、肉桂為關(guān)鍵詞，檢索其含有的化學(xué)成分。并依據(jù)口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)進(jìn)行篩選，閾值分別設(shè)為：OB≥25%，DL≥0.18。并依據(jù)參考文獻(xiàn)〔4〕將DL<0.18但具有生物活性的少數(shù)分子增補(bǔ)為候選活性成分。

基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)，將可能性(Probability)設(shè)置為≥0.7，提取上述候選活性成分的潛在作用靶點(diǎn)；TCMSP檢索候選活性成分作用靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)轉(zhuǎn)換后作為補(bǔ)充。

1.2滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用靶點(diǎn)的獲取 在The Human Phenotype Ontology(HPO)疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(https://hpo.jax.org/app/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org)分別以疾病名稱“hypertension”、“myocardial fibrosis”、“l(fā)eft ventricular hypertrophy”等檢索高血壓左室肥大相關(guān)基因。

利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具進(jìn)行滋腎活絡(luò)方候選活性成分靶點(diǎn)和高血壓左室肥大相關(guān)靶點(diǎn)的映射并繪制韋恩圖，將兩部分的交集靶點(diǎn)為滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的作用靶點(diǎn)。

1.3滋腎活絡(luò)方單味藥-活性分子-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將單味藥、活性成分、作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape繪制單味藥-活性成分、活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，采用Merge功能繪制單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，基于構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)分析滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的作用機(jī)制。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 利用STRING平臺將滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的作用靶點(diǎn)構(gòu)建靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI network)，組合分?jǐn)?shù)閾值>0.4。應(yīng)用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，Network Analyzer功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)整體的度值和介數(shù)兩個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)，評價(jià)滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5活性成分分子與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接 基于上述PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選Degree值最高的5個(gè)靶點(diǎn)，以Ledock軟件，與活性成分分子進(jìn)行對接，以原蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)中配體與靶點(diǎn)的結(jié)合能為參照，評價(jià)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合潛力驗(yàn)證預(yù)測的可靠性。

1.6滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用靶點(diǎn)的基因功能和信號通路分析 將滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)，限定物種為Homo sapiens，Min Overlap為3，Min Enrichment為1.5，P<0.01，進(jìn)行基因本體論(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1滋腎活絡(luò)方化學(xué)成分與預(yù)測靶點(diǎn) 通過TCMSP收集到滋腎活絡(luò)方6味中藥的432個(gè)化學(xué)成分，結(jié)合文獻(xiàn)檢索和設(shè)定篩選條件進(jìn)行篩選，得到67個(gè)成分，其中9個(gè)來自玄參，21個(gè)來自牛膝，8個(gè)來自益母草，14個(gè)來自黃連，11個(gè)來自牡丹皮，4個(gè)來自肉桂，去重后保留55個(gè)候選活性成分。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫和TCMSP對候選活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，有42個(gè)成分能找到對應(yīng)潛在靶點(diǎn)241個(gè)，共計(jì)得到滋腎活絡(luò)方949個(gè)“成分-靶點(diǎn)”對應(yīng)信息，展現(xiàn)了滋腎活絡(luò)方多成分、多靶點(diǎn)的作用特征。

2.2滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的作用靶點(diǎn) 通過HPO數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，得到高血壓左室肥大相關(guān)靶點(diǎn)538個(gè)，與241個(gè)候選活性成分預(yù)測靶點(diǎn)取交集得到47個(gè)靶點(diǎn)，為滋腎活絡(luò)方改善高血壓心肌肥厚作用靶點(diǎn)，包括腎上腺素受體(ADR)α1A、ADRB1、一氧化氮合酶(NOS)3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)γ、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)1等。

2.3單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將滋腎活絡(luò)方6個(gè)單味藥、42個(gè)成分和47個(gè)改善高血壓左室肥大作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建單味藥-活性成分、活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，采用Merge合并，去除不相關(guān)靶點(diǎn)，得到單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中91個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含6個(gè)單味藥、38個(gè)成分和47個(gè)靶點(diǎn)，304條邊表示藥物、成分和靶點(diǎn)之間相互關(guān)系。將這38個(gè)成分視為滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的活性成分，包括黃酮類(槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、山奈酚等)、植物固醇類(β-谷甾醇、豆甾醇等)、脂肪酸(油酸、花生四烯酸、棕櫚油酸等)和生物堿類(小檗堿、甲基黃連堿、小檗紅堿、表小檗堿等)等，見表1。

(◆)表示中藥材；(●)表示化學(xué)成分；()表示作用靶點(diǎn)圖1 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的活性成分信息

續(xù)表1 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的活性成分信息

2.4靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn) 將預(yù)測的滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)有47個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白互作，302條相互作用線。其中度值、介數(shù)越大顏色越深，說明蛋白相互作用越強(qiáng)。PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為13.23，平均介數(shù)為1.90×10-2，度值、介數(shù)均超過平均值的12個(gè)靶蛋白，見表2，處于PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置，可能是滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大作用關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)

2.5滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接 為評價(jià)活性成分與預(yù)測靶點(diǎn)的潛在結(jié)合能力，以前述38個(gè)活性成分為配體，與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最高的5個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行對接。三維結(jié)構(gòu)數(shù)值均來自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)，分別為AKT1(PDB代碼：1H10)，TNF(PDB代碼：2AZ5)，IL-6(PDB代碼：1ALU)，NOS3(PDB代碼：1M9J)，IL-1β(PDB代碼：2NVH)，以原蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)中配體與靶點(diǎn)的結(jié)合能為參照，對接結(jié)合能數(shù)據(jù)如圖2所示。結(jié)果顯示鼬瓣花素、柳杉酚、黃芩素等34個(gè)活性成分與IL-1β的結(jié)合能低于原配體；槲皮素、漢黃芩素、山奈酚等26個(gè)活性成分與IL-6的結(jié)合能低于原配體；異鼠李素、兒茶素、黃藤素等15個(gè)活性成分與NOS3的結(jié)合能低于原配體；14-去氧-12(R)-磺酸基穿心蓮內(nèi)酯與TNF的結(jié)合能低于原配體，鼬瓣花素與AKT1有一定的結(jié)合能力，結(jié)合能略高于原配體。上述結(jié)果說明滋腎活絡(luò)方的活性成分與預(yù)測的作用靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力，提示預(yù)測結(jié)果基本可靠。

參考對照虛線為原蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)中配體與靶點(diǎn)的結(jié)合能圖2 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大活性成分與AKT1、TNF、IL-6、NOS3及IL-1β分子對接結(jié)果

2.6滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因功能分析 對滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大47個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，歸類分析結(jié)果顯示涉及的生物學(xué)過程包括血液循環(huán)、調(diào)節(jié)血壓、負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、第二信使介導(dǎo)的信號、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、脂肪細(xì)胞分化、細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)正調(diào)控、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)氮化物的反應(yīng)、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)等20個(gè)功能分類；涉及的分子功能主要包括RNA聚合酶Ⅱ抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、整合素結(jié)合、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、氧化還原酶活性、生長因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、激素結(jié)合、支架蛋白結(jié)合等15個(gè)功能分類；涉及的細(xì)胞組分主要包括原纖維膠原三聚體、囊泡腔、肌膜、受體復(fù)合物、膜筏等功能分類。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，47個(gè)靶點(diǎn)顯著富集于12大類117條通路上，主要涉及通路見圖3。

MAPK：絲裂原活化蛋白激酶，PPAR：過氧化物酶體增殖物激活受體圖3 滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大靶點(diǎn)KEGG富集圖

3 討 論

左室肥大是高血壓進(jìn)程中心臟應(yīng)對壓力負(fù)荷出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)及功能變化，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大及心肌成纖維細(xì)胞過度增殖活化導(dǎo)致的膠原沉積和間質(zhì)纖維化〔1〕。滋腎活絡(luò)方為改善高血壓心肌肥厚的臨床驗(yàn)方〔2〕，以玄參、懷牛膝為君，滋補(bǔ)腎陰；黃連為臣，清心降火；佐以丹皮、益母草活血暢通心脈；肉桂溫腎助陽，引火歸原，為佐使藥。諸藥相合，共奏滋腎清心通絡(luò)之功，使腎陰得補(bǔ)，心火清降，瘀去水行，脈絡(luò)通暢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與中醫(yī)藥整體觀思想基本一致，有助于預(yù)測該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，系統(tǒng)闡釋其作用機(jī)制，為后續(xù)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果提示方中君藥和臣藥起主要治療作用，佐藥和使藥亦發(fā)揮作用，表現(xiàn)了組方的合理性。部分成分的藥理作用已得到證實(shí)，如槲皮素具有抗高血壓作用〔5〕，亦可降低自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織膠原含量，改善心肌超微結(jié)構(gòu)和心功能，逆轉(zhuǎn)其心室肥厚〔6〕；黃芩素能夠顯著減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓和心肌重構(gòu)〔7〕；小檗堿和肉桂醛均可抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠左心室肥大〔8,9〕，肉桂醛還可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞活化〔10〕。

通過將篩選的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證了預(yù)測結(jié)果的可靠性。且對接結(jié)果顯示玄參活性成分14-去氧-12(R)-磺酸基穿心蓮內(nèi)酯與四個(gè)靶點(diǎn)(TNF、IL-6、NOS3和IL-1β)的結(jié)合能、牛膝和黃連共有活性成分槲皮素與三個(gè)靶點(diǎn)(IL-6、NOS3和IL-1β)的結(jié)合能均低于原蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)配體與靶點(diǎn)的結(jié)合能。

基于活性成分與已知配體相似度預(yù)測成分潛在靶點(diǎn)，整合基于疾病數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶點(diǎn)，獲得滋腎活絡(luò)方改善高血壓左室肥大的47個(gè)靶點(diǎn)。這些作用靶點(diǎn)通過影響心肌肥大、纖維化和心臟功能等方面參與左室肥大進(jìn)程。PI3K與其下游主要效應(yīng)物AKT和心肌細(xì)胞大小及存活密切相關(guān)〔11〕，有研究發(fā)現(xiàn)AKT1基因敲除小鼠心肌質(zhì)量降低〔12〕。MMP-9參與心肌間質(zhì)膠原的降解，為預(yù)測心肌纖維化標(biāo)志物之一〔13〕；壓力負(fù)荷下心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-1β和TNF-α等可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞活化，啟動纖維化進(jìn)程〔14〕，在心肌肥厚炎癥反應(yīng)中起主要作用。NOS3為血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO關(guān)鍵酶，抑制NOS可以導(dǎo)致心臟肥大和炎癥狀態(tài)〔15〕，加劇壓力超負(fù)荷小鼠的左室功能障礙和肥厚〔16〕。VEGF是一種重要的促血管生成細(xì)胞因子，可改善心臟功能并防止實(shí)驗(yàn)性心肌梗死小鼠心臟發(fā)生左心室重構(gòu)〔17〕。靶點(diǎn)生物學(xué)過程分析結(jié)果提示調(diào)節(jié)心肌肥厚中的炎癥反應(yīng)是該方主要作用機(jī)制之一。

基于KEGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，滋腎活絡(luò)方靶點(diǎn)的代謝通路主要涉及鈣信號、腎上腺素能受體信號、5-羥色胺能突觸、MAPK信號、PPAR信號等信號通路。鈣信號是導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的最基本信號〔18〕，高血壓時(shí)壓力負(fù)荷造成的機(jī)械牽張刺激可通過激活牽張敏感的離子通道導(dǎo)致Ca2+釋放波〔19〕；局部增高的兒茶酚胺結(jié)合腎上腺素能β1受體，可磷酸化激活細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)Ca2+通道，觸發(fā)鈣信號介導(dǎo)的心肌肥大〔19〕。5-羥色胺不僅是高血壓致病因素之一，亦有獨(dú)立于血流動力學(xué)之外的調(diào)節(jié)心肌重構(gòu)作用。研究證實(shí)，5-羥色胺可誘發(fā)小鼠心內(nèi)膜下左室纖維化，而HT2AR基因敲除小鼠心肌纖維化減輕〔20〕，心臟中過表達(dá)HT2BR會出現(xiàn)心肌細(xì)胞數(shù)量和大小增加，導(dǎo)致心室肥大〔21〕，抑制HT2BR可減輕主動脈縮窄大鼠的心臟肥大〔22〕。MAPK可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大、炎性反應(yīng)、成纖維細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡〔23,24〕，在調(diào)節(jié)心臟肥厚中發(fā)揮重要作用。壓力超負(fù)荷小鼠心臟組織中3個(gè)主要MAPK通路均被激活〔25〕，通過促進(jìn)心肌細(xì)胞生長、減少間隙連接形成、促進(jìn)心臟纖維化〔26〕等促進(jìn)病理性心肌肥大的發(fā)展。PPAR家族(PPARα、β/δ、γ)是心臟代謝的重要調(diào)節(jié)劑，在心臟肥大的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用〔27〕。在壓力超負(fù)荷小鼠模型中，PPARα敲除的小鼠表現(xiàn)出較野生型小鼠更明顯的心臟肥大和心臟功能障礙〔28〕；成年小鼠心臟中PPARβ/δ的激活可改善壓力超負(fù)荷條件下的心臟功能并抑制心肌纖維化〔29〕；心臟特異性PPARγ基因敲除會誘發(fā)小鼠心肌肥大〔30〕。