TMEM230-A110T突變體對多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞自噬、增殖及凋亡的影響

楊百元 李柯麓 劉彬 朱永云 殷康福 尹蔚芳 任惠 楊興隆

帕金森病(PD)是目前僅次于阿爾茨海默病的第二大最常見的神經(jīng)變性綜合征[1]。盡管目前對其病理生理學(xué)(包括遺傳和生化原因)研究方面取得長足進(jìn)步，但對其診斷仍缺乏準(zhǔn)確性。因此，尋找敏感、可靠、特異性高的生物標(biāo)志物，將對PD患者的臨床管理和治療具有重要意義?？缒さ鞍?30(TMEM230)基因?qū)儆赥MEM134/TMEM230蛋白質(zhì)家族的多通道跨膜蛋白，其編碼的蛋白定位于神經(jīng)元中，可能參與突觸囊泡的運(yùn)輸和再循環(huán)[2]，且已被證實(shí)是一種具有路易病理和典型臨床癥狀的常染色體顯性PD的新型致病基因[3]。作者團(tuán)隊(duì)曾從中國西南地區(qū)的PD患者中篩查出TMEM230-A110T突變體，并推測其為可能為致病性突變體[4]。自噬是一種去除細(xì)胞內(nèi)多余或有缺陷細(xì)胞成分的降解過程。研究發(fā)現(xiàn)：PD患者黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元存在自噬變性[5]；LRRK2 G2019S突變體的敲可入升高PD模型小鼠自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ水平[6]；攜帶雜合性GBA L444P突變體的PD患者死后腦組織線粒體水平增加，線粒體氧化應(yīng)激和自噬受損[7]。本研究通過探討TMEM230-A110T突變體是否通過調(diào)控自噬參與PD的發(fā)生發(fā)展，旨在為PD的診斷和治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分化人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)采用專用培養(yǎng)基置37℃，5% CO2(體積分?jǐn)?shù))培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用0.25%(質(zhì)量濃度)胰蛋白酶消化，調(diào)整SH-SY5Y細(xì)胞水平至6×104/mL接種至6孔板。培養(yǎng)24 h后，更換含10 μL全反式維甲酸(RA)和15% FBS(體積分?jǐn)?shù))的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d。隨后，更換含50 ng/mL腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。從分化開始的第0、3、6、9天利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照。分化成熟的DA神經(jīng)細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)突起至少有一條直徑是胞體的兩倍以上。

1.2 主要試劑RA和BDNF購買于美國Sigma，c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路抑制劑SP600125和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路抑制劑SB203580購買于美國MCE，pFLAG-CMV3-TMEM230-A110T突變表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P設(shè)計(jì)和構(gòu)建，si-Beclin-1和pcDNAi-Beclin-1由上海吉滿設(shè)計(jì)和構(gòu)建，Trizol試劑、PrimeScript RT reagent Kit和PrimeScriptTMRT-PCR Kit購買于大連寶生物，Lipofectamine 2000、BCA試劑盒及RIPA裂解液購買于美國Thermo Scientifi，CCK-8試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒購買于北京索萊寶，Western Blotting一抗及二抗購買于美國CST，GFP-LC3試劑盒購買于上海漢恒。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染：將分化成熟的DA能神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為WT組、MUT組、SP600125組、SB203580組、si-Beclin-1組和SP600125+pcDNA-Beclin-1組(以下簡稱pcDNA-Beclin-1組)。WT組為未特殊處理的DA能神經(jīng)細(xì)胞；MUT組細(xì)胞給予轉(zhuǎn)染TMEM230-A110T突變體載體；SP600125組和SB203580組細(xì)胞在MUT組的基礎(chǔ)上分別給予40 nmol/L SP600125和50 nmol/L SB203580處理；si-Beclin-1組為在MUT組的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染si-Beclin-1；pcDNA-Beclin-1組為在SP600125組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染pcDNA-Beclin-1。轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine 2000試劑盒步驟操作，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2Western blotting檢測：采用RIPA裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)，采用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒量化蛋白質(zhì)濃度。取10 μg提取物在10%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下，在含5%(質(zhì)量濃度)脫脂牛奶的TBST中封閉1 h后，加入一抗，孵育過夜。然后，加入相應(yīng)二抗后，室溫封閉1 h。ECL化學(xué)發(fā)光底物顯示蛋白質(zhì)條帶。以β-actin作為內(nèi)參，用ImageJ軟件定量分析神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、酪氨酸羥化酶(TH)、TMEM230、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax凋亡調(diào)節(jié)因子(Bax)、自噬蛋白5(Atg5)、Atg12、自噬蛋白6同源物(Beclin-1)、自噬相關(guān)泛素樣修飾因子LC3 B(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬受體P62(P62)、JNK/p38 MAPK相關(guān)蛋白(JNK和p-p38)蛋白條帶的灰度值。

1.3.3CCK-8檢測DA能神經(jīng)細(xì)胞活性：取各組對數(shù)生長期DA能神經(jīng)細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測定其450 nm處吸光度值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4細(xì)胞凋亡檢測：取各組對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞水平為2.5×105/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于6孔板，培養(yǎng)72 h。加入Binding buffer漂洗細(xì)胞，并加入250 μL Binding buffer重新懸浮細(xì)胞。隨后分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI(20 μg/mL)，充分混勻后室溫下避光孵育10 min；再加入Binding buffer使反應(yīng)體積達(dá)到500 μL，采用流式細(xì)胞儀檢測DA能神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.5DA能神經(jīng)細(xì)胞自噬水平檢測：用pH=7.4的2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛冷凍固定細(xì)胞。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，以1%(質(zhì)量濃度)四氧化鋨固定細(xì)胞1 h。樣品經(jīng)一系列不同濃度乙醇脫水，并包埋在Spurr樹脂中。超薄切片(片厚70 nm)，行醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。置JEM-1230透射電子顯微鏡下觀察各組DA能神經(jīng)細(xì)胞自噬小體并拍照。將GFP-LC3病毒載體轉(zhuǎn)染至DA能神經(jīng)細(xì)胞48 h后，采用4%(體積分?jǐn)?shù))甲醛固定10 min。使用BX60熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光狀態(tài)并拍攝圖片，采用Image J軟件分析各組GFP-LC3斑點(diǎn)數(shù)目。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；兩組均數(shù)間比較采獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DA能神經(jīng)細(xì)胞模型構(gòu)建未分化的SH-SY5Y細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則及多邊形等；隨RA/BDNF處理時(shí)間延長，SH-SY5Y細(xì)胞體逐漸變小且伸出樹突狀突起，S型細(xì)胞的形態(tài)逐漸消失；第6天，SH-SY5Y細(xì)胞樹突狀突起至少是胞體的兩倍以上(圖1)。不同分化時(shí)間點(diǎn)SH-SY5Y細(xì)胞間NSE、TH蛋白表達(dá)水平比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=51.142，P<0.01；F=250.159，P<0.01)，與第0天比較，第3、6、9天SH-SY5Y細(xì)胞NSE、TH蛋白表達(dá)升高(圖2～3)。

注：RA：全反式維甲酸；BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

注：RA：全反式維甲酸；BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；NSE：神經(jīng)元特異性烯醇化酶；TH：酪氨酸羥化酶

注：RA：全反式維甲酸；BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；NSE：神經(jīng)元特異性烯醇化酶；TH：酪氨酸羥化酶；與0 d比較，aP<0.05，bP<0.01

2.2 各組DA能神經(jīng)細(xì)胞增殖比較細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h時(shí)，MUT組DA能神經(jīng)元細(xì)胞增殖較WT組減少(P<0.05或P<0.01)，SP600125組細(xì)胞增殖較MUT組增加(P<0.01)，而pcDNA-Beclin-1組較SP600125組降低(P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.3 TMEM230-A110T突變體對JNK/p38 MAPK/Beclin-1途徑的影響各組DA能神經(jīng)細(xì)胞TMEM230(F=10.978，P<0.01)、JNK(F=36.219，P<0.01)、p-p38(F=51.689，P<0.01)和Beclin-1(F=10.336，P<0.01)蛋白表達(dá)水平比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩兩比較結(jié)果顯示，與WT組比較，MUT組JNK、p-p38和Beclin-1蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)；與MUT組比較，SP600125組JNK、p-p38和Beclin-1蛋白表達(dá)減少，SB203580組p-p38和Beclin-1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與SP600125組比較，si-Beclin-1組JNK和p-p38蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與WT組比較，MUT組、SP600125組、SB203580組和si-Beclin-1組TMEM230表達(dá)均降低(圖4～5)。

2.4 各組DA能神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較各組DA能神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例及Caspase-3(F=34.586，P<0.01)、Bcl-2(F=48.371，P<0.01)、Bax(F=49.320，P<0.01)比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與WT組比較，MUT組Bcl-2表達(dá)減少，Caspase-3和Bax表達(dá)及凋亡比例增加(P<0.05或P<0.01)；與MUT組比較，SP600125組Bcl-2表達(dá)增加，Caspase-3和Bax表達(dá)及凋亡比例降低(P<0.05或P<0.01)；與SP600125組比較，pcDNA-Beclin-1組Bcl-2表達(dá)降低，Caspase-3和Bax表達(dá)及凋亡比例增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1和圖6～8。

注：DA：多巴胺；TMEM230：跨膜蛋白230；JNK ：c-Jun氨基末端激酶；Beclin-1：自噬蛋白6同源物

注：DA：多巴胺；TMEM230：跨膜蛋白230，JNK ：c-Jun氨基末端激酶；Beclin-1：自噬蛋白6同源物；aP<0.05；bP<0.01

表1 各組DA能神經(jīng)元增殖(CCK-8法)及細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))情況比較

注：DA：多巴胺；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：凋亡調(diào)控因子

2.5 各組DA能神經(jīng)細(xì)胞模型自噬比較與WT組比較，MUT組神經(jīng)元自噬小體和LC-3斑點(diǎn)數(shù)量增加；與MUT組比較，SP600125組DA能神經(jīng)元自噬小體和LC-3斑點(diǎn)數(shù)量減少；與SP600125組比較，pcDNA-Beclin-1組自噬小體和LC-3斑點(diǎn)數(shù)量增加(圖9～10)。各組DA能神經(jīng)細(xì)胞Atg5(F=18.225，P<0.01)、Atg12(F=31.814，P<0.01)、P62(F=19.442，P<0.01)蛋白表達(dá)以及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例(F=21.946，P<0.01)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與WT組比較，MUT組細(xì)胞Atg5、Atg12蛋白表達(dá)及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例增加，而P62蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與MUT組比較，SP600125組細(xì)胞Atg5、Atg12蛋白表達(dá)及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例表達(dá)減少，而P62表達(dá)增加(P<0.05)；與SP600125組比較，pcDNA-Beclin-1組細(xì)胞Atg5、Atg12蛋白表達(dá)及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例增加，P62蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)果見圖11～12。

注：DA：多巴胺；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：凋亡調(diào)控因子；aP<0.05；bP<0.01

注：DA：多巴胺

注：DA：多巴胺

注：DA：多巴胺

注：DA：多巴胺；Atg5/12：自噬蛋白5/12；LC3 B(LC3Ⅱ/Ⅰ)：自噬相關(guān)泛素樣修飾因子；P62：自噬受體P62

注：DA：多巴胺；Atg5/12：自噬蛋白5/12；LC3 B(LC3Ⅱ/Ⅰ)：自噬相關(guān)泛素樣修飾因子；P62：自噬受體P62；aP<0.05；bP<0.01

3 討論

中腦DA能神經(jīng)元是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA的主要來源。DA能神經(jīng)元的喪失與神經(jīng)退行性疾病PD有關(guān)[8]。到目前為止，至少有23個(gè)致病位點(diǎn)和19個(gè)基因在PD單基因家系中被報(bào)道，其大多為PD的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因[9]，但其在PD中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，TMEM230-A110T突變體可通過調(diào)控DA能神經(jīng)細(xì)胞自噬抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡，且JNK/p38 MAPK/Beclin-1途徑參與TMEM230-A110T突變體對DA能神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控。

近年來研究證實(shí)，TMEM230是一種參與囊泡運(yùn)輸?shù)男禄?，被證實(shí)與PD相關(guān)。TMEM230中的一個(gè)錯(cuò)義突變(c.422G>T；p.Arg141Leu)在北美的一個(gè)3代大家庭譜系中首次被發(fā)現(xiàn)。隨后，兩個(gè)新的突變體p.G16W和p.M64V以及6個(gè)已知的錯(cuò)義突變體僅在PD患者中被檢測到[10]，盡管多項(xiàng)研究未能在TMEM230基因中找到與PD相關(guān)的致病變異[11]，但依然提示這些TMEM230突變體可能在PD的致病性或易感性中發(fā)揮作用。作者團(tuán)隊(duì)前期研究亦發(fā)現(xiàn)，攜帶TMEM230 A110T突變體的2例中國西南地區(qū)病例均有典型的多巴反應(yīng)的PD癥狀[4]。然而，目前關(guān)于TMEM230 A110T突變體對PD的作用尚不清楚。本研究通過向DA能神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染TMEM230 A110T突變體發(fā)現(xiàn)，DA能神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡增加，且增殖能力降低，提示TMEM230 A110T極有可能通過調(diào)控DA能神經(jīng)細(xì)胞的生物表型參與PD的發(fā)展進(jìn)程，是潛在的PD診斷和治療靶標(biāo)。

自噬途徑是一種真核生物進(jìn)化上保守的周轉(zhuǎn)過程，在清除長壽蛋白、聚集蛋白或功能障礙的細(xì)胞器時(shí)發(fā)揮重要作用，并能夠提供能量和大分子前體[12]。大量研究表明，PD相關(guān)的α-突觸核蛋白和tau蛋白的聚集是自噬溶酶體降解受損的結(jié)果[13-14]，p38 MAPK和JNK信號通路的異常激活能通過調(diào)控自噬參與PD進(jìn)程。miR-326通過JNK信號促進(jìn)DA能神經(jīng)元自噬[15]。α-突觸核蛋白A30P突變體通過抑制JNK信號激活來增強(qiáng)DA能神經(jīng)元中ZKSCAN3的活性，從而損害自噬通量[16]。此外，p38 MAPK/mTOR信號通路的激活會(huì)促進(jìn)自噬，進(jìn)而觸發(fā)斑馬魚的PD樣癥狀[17]。Liu等研究亦表明，p38 MAPK/JNK信號通路參與調(diào)控PD細(xì)胞凋亡和自噬過程[18]。本研究結(jié)果顯示，TMEM230 A110T突變體能夠激活JNK/p38MAPK/Beclin-1通路，且通過調(diào)控該通路促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞的自噬。此外，Yan等[19]研究表明，IRE1能夠調(diào)控PD果蠅模型中的自噬并介導(dǎo)神經(jīng)元的增殖和凋亡。本研究結(jié)果顯示，采用SP600125處理轉(zhuǎn)染TMEM230 A110T突變體的DA能神經(jīng)元后，細(xì)胞的自噬能力降低，細(xì)胞增殖能力增加，凋亡下降；而過表達(dá)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1后，轉(zhuǎn)染TMEM230 A110T突變體的DA能神經(jīng)元增殖減少，且凋亡增加，表明TMEM230 A110T突變體通過激活JNK/p38MAPK/Beclin-1通路增強(qiáng)DA能神經(jīng)元自噬，從而介導(dǎo)神經(jīng)元增殖和凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，TMEM230 A110T突變體可能通過激活JNK/p38MAPK/ Beclin-1途徑促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞自噬，進(jìn)而抑制DA能神經(jīng)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這為進(jìn)一步研究PD的發(fā)病機(jī)制以及治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。