LRRK2干擾對MPP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型線粒體功能的影響

羅寧 王春玲 蒙冰 周欣梅 馮文勇 李昌海 文曉東

帕金森病(Parkinson disease，PD)是神經(jīng)科常見的慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為行動遲緩以及肢體僵直、震顫等典型癥狀，其發(fā)病主要由黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性引起[1-2]。多種機(jī)制共同作用參與PD的發(fā)病，其中富亮氨酸重復(fù)激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因突變是引起PD最常見的原因之一[3]。LRRK2依賴性神經(jīng)退行性病變與囊泡運(yùn)輸、自噬、線粒體穩(wěn)態(tài)和鈣穩(wěn)態(tài)等密切相關(guān)[4]。研究證實(shí)，線粒體是鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2(CaMKK-β)/腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要細(xì)胞器，線粒體功能障礙常會引起PD等神經(jīng)退行性疾病，是PD發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制之一[5-6]。目前有關(guān)LRRK2與線粒體功能和CaMKK-β/AMPK通路之間的作用關(guān)系尚不清楚。本研究通過體外建立1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridine ion，MPP+)誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，探討LRRK2干擾對線粒體功能和CaMKK-β/AMPK通路的影響，為深入了解PD的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 主要試劑DMEM/F12(SH30023.01)購自Hyclone公司；胎牛血清(10270-106)、Opti-MEM(31985-062)購自Gibco公司；IPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液(R0010)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)購自Solarbio公司；ATP含量檢測試劑盒(A095-1-1)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ι(Complex Ι)活性測試試劑盒(A089-1-1)購自南京建成生物工程研究所；MPP+碘化物(D048)購自Sigma公司；Lipofectamine?RNAiMAX(13778030)購自Invitrogen公司；Trizol(15596026)購自Ambion；SYBR FAST qPCR Master Mix(KM4101)購自KAPA Biosystems；Oligo(dT)18 Primer(3806)、PrimeScript Ⅱ Rtase(2690A)、Recombinant Rnase Inhibitor(2313A)、10 mmol/L dNTP Mix(PC2200)購自Takara；DNase/RNase-Free Water(PC2200)購自Solarbio；線粒體膜電位檢測試劑盒(PC2200)購自Beyotime；兔源LRRK2多克隆抗體(PAB44040)、兔源AMPK多克隆抗體(PAB30970)、兔源p-AMPK多克隆抗體(PA5-37821)、兔源GAPDH多克隆抗體(PAB36269)、二抗羊抗兔IgG(SAB43714)均購自Bioswamp；兔源CAMKK-β多克隆抗體(ab168818)為Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)：將凍存的SH-SY5Y細(xì)胞從液氮罐中取出后，移至37℃水浴鍋中，使細(xì)胞迅速融化。待凍存液完全融化后，將細(xì)胞懸液吸至離心管中，加入4 mL完全培養(yǎng)基(100 mL完全培養(yǎng)液含43.5 mL MEM、43.5 mL F12、10 mL FBS、1 mL Gluta-max、1 mL Sodium pyruvate、1 mL NEAA)，以4℃、400g離心3 min，棄上清，細(xì)胞重新懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，按1∶2～1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2MPP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型：收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液水平至每孔3×103個(gè)細(xì)胞，每孔100 μL，置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁，分別用125、250、500、1000、2000 μmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞24、48、72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并正常對照組。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)MPP+處理后存活率降低并呈劑量依賴性，最終確定采用2000 μmol/L MPP+處理48 h用于PD細(xì)胞模型的構(gòu)建。

1.3.3siRNA-LRRK2的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率鑒定：根據(jù)LRRK2基因序列設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA序列和NC序列，交由廣州市銳博生物科技有限公司合成。以未轉(zhuǎn)染的PD細(xì)胞模型作為對照，嚴(yán)格按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法說明書操作，分別將siRNA-LRRK2-1(GCATCATGGTTGAATGCTT)、 siRNA-LRRK2-2(GTACTCTCCTGGTCATCAA)、siRNA-LRRK2-3 (GCAACTGACTGAATTTGTT) 轉(zhuǎn)染至構(gòu)建好的PD細(xì)胞模型，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞板置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。24 h后收集細(xì)胞添加Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，LRRK2上游引物序列為：5′-CCAATCAAGCAAAGGAGGGA-3′，下游引物序列為：5′-AAAGGACCAAGCCAAGAAGG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物序列為：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s、56℃退火10 s、72℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)添加溶解曲線。LRRK2相對表達(dá)量采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.3.4線粒體膜電位檢測：將細(xì)胞分成正常對照組、PD模型組、空載轉(zhuǎn)染組(空載轉(zhuǎn)染PD模型24 h)、siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA-LRRK2轉(zhuǎn)染PD模型24 h)，每組設(shè)置3復(fù)孔，分別加入JC-1熒光探針，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位，使用NovoCyte軟件進(jìn)行分析。

1.3.5ATP含量檢測：收集“1.3.4”4組細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，離心沉淀，并嚴(yán)格參照ATP含量測試試劑盒的說明書操作，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清用于測定，并根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞ATP含量：ATP含量=(樣本吸光度值-對照吸光度值)÷(標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-空白吸光度值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)÷樣本蛋白濃度。

1.3.6Complex I活性檢測：收集“1.3.4”4組細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格參照Complex I活性測試試劑盒的說明書操作，將胞漿蛋白與線粒體蛋白分離，用酶標(biāo)儀測定，獲得樣本總活性和樣本非特異性活性，并按照下列公式計(jì)算細(xì)胞Complex I的活性。Complex I活性=樣本總活性-樣本非特異性活性。

1.3.7CaMKK-β/AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：收集“1.3.4”4組細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液充分裂解細(xì)胞并提取蛋白，用BCA試劑盒檢測對蛋白進(jìn)行定量分析，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別加入兔源LRRK2抗體(1∶1000)、兔源AMPK抗體(1∶1000)、兔源p-AMPK抗體(1∶1000)、兔源GAPDH抗體(1∶1000)、兔源CAMKK-β抗體(1∶1000)孵育，再用羊抗兔IgG(1∶20000)孵育，ECL顯影，檢測細(xì)胞LRRK2、CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2對PD細(xì)胞模型LRRK2表達(dá)的影響

2.1.1qRT-PCR檢測siRNA干擾效率：結(jié)果見圖1。各組細(xì)胞LRRK2 mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=41.12，P<0.01)。與PD模型組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2-1和siRNA-LRRK2-2后，MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型LRRK2 mRNA表達(dá)水平均下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2-3和空載轉(zhuǎn)染組LRRK2 mRNA表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05)。轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2-1對LRRK2的干擾效果最好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：PD：帕金森病，圖2～6、表1同；LRRK2：富亮氨酸重復(fù)激酶2，圖2～4同；aP<0.05

注：aP<0.05

2.1.2各組細(xì)胞LRRK2蛋白表達(dá)：結(jié)果見圖2。

圖 3 轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2-1對PD模型細(xì)胞膜電位的影響(流式細(xì)胞術(shù))

各組細(xì)胞LRRK2蛋白相對表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=888.08，P<0.01)。與正常對照組比較，PD模型組和空載轉(zhuǎn)染組細(xì)胞LRRK2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，與PD模型組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組LRRK2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

2.2 LRRK2干擾對PD細(xì)胞模型線粒體功能的影響

2.2.1各組線粒體膜電位比較：各組細(xì)胞Q2-4區(qū)細(xì)胞比例的差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=794.77，P<0.01)。與正常對照組比較，PD模型組和空載轉(zhuǎn)染組Q2-4區(qū)的細(xì)胞數(shù)均增加(P<0.05)，表明線粒體膜電位下降；與PD模型組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組Q2-4區(qū)的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，表明膜電位提升。結(jié)果見圖3和圖4。

注：aP<0.05

2.2.2各組細(xì)胞ATP含量和Complex I活性檢測：結(jié)果見表1。與正常對照組比較，PD模型組和空載轉(zhuǎn)染組ATP含量和Complex I活性均下降(P<0.05)；與PD模型組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-LRRK2-1后ATP含量和Complex I活性均升高(P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞ATP含量和Complex I

2.3 LRRK2干擾對PD細(xì)胞模型CaMKK-β/AMPK信號通路的影響各組細(xì)胞CaMKK-β (F=1027.07，P<0.01)、p-AMPKα(Thr 172) (F=828.95，P<0.01)、AMPK(F=953.30，P<0.01)蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常對照組比較，PD模型組和空載轉(zhuǎn)染組CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)；與PD模型組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組上述蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。結(jié)果見圖5和圖6。

注：CaMKK-β：鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2；AMPK：腺苷酸激活蛋白激酶；p-AMPK：磷酸化的腺苷酸激活蛋白激酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

注：CaMKK-β：鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2；AMPK：腺苷酸激活蛋白激酶；p-AMPK：磷酸化的腺苷酸激活蛋白激酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；aP<0.05

3 討論

線粒體穩(wěn)態(tài)異常是PD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因之一[5]。Complex I異常會抑制ATP的產(chǎn)生并導(dǎo)致線粒體功能受損[7]，而線粒體功能障礙通常會引起PD等神經(jīng)退行性疾病[6]。研究表明，在神經(jīng)樣分化細(xì)胞中，加入Complex I抑制劑魚藤酮可誘導(dǎo)LRRK2在絲氨酸935p-(S935)位點(diǎn)磷酸化，并伴隨細(xì)胞死亡[7]。MPP+與魚藤酮均為Complex I抑制劑，多項(xiàng)研究證實(shí)MPP+可成功誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型用于體外研究[8-9]。該結(jié)果顯示，MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞中線粒體膜電位下降，Complex I活性顯著下降，ATP含量減少，提示在PD發(fā)生過程中線粒體功能受到了影響。

線粒體是CaMKK-β/AMPK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的主要細(xì)胞器。AMPK是一種重要的能量代謝調(diào)節(jié)因子，因能量壓力或者ATP減少而被激活[10]，通過磷酸化多種蛋白質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11]。CaMKK-β也是神經(jīng)元功能和全身能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]，在神經(jīng)元中CaMKK-β是調(diào)控AMPK激活和磷酸化的關(guān)鍵激酶[13]。該研究結(jié)果顯示，PD細(xì)胞模型中CaMKK-β/AMPK信號通路處于激活狀態(tài)，CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)蛋白表達(dá)均顯著增加，推測其原因可能與受損的線粒體產(chǎn)生的ATP減少有關(guān)，表明CaMKK-β/AMPK信號通路與線粒體穩(wěn)態(tài)和PD的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系。

LRRK2基因參與調(diào)節(jié)PD發(fā)生過程中的線粒體穩(wěn)態(tài)。已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明LRRK2在線粒體功能中發(fā)揮作用，然而確切機(jī)制尚不清楚[4]。該研究通過轉(zhuǎn)染siRNA干擾LRRK2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Complex I活性及ATP含量顯著增加，受損的線粒體功能得到一定的恢復(fù)，表明LRRK2在調(diào)節(jié)線粒體功能障礙和維持線粒體功能方面具有重要作用。Tozzi等[12]研究發(fā)現(xiàn)抑制LRRK2的表達(dá)可導(dǎo)致多巴胺(DA)神經(jīng)元損傷，降低腦內(nèi)DA水平，其機(jī)制可能為通過下調(diào)CaMKK-β/AMPK信號通路中AMPK磷酸化水平，從而減弱其在腦內(nèi)的神經(jīng)元保護(hù)作用。該研究結(jié)果顯示，PD模型細(xì)胞經(jīng)干擾LRRK2后其CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)蛋白表達(dá)均降低，提示CaMKK-β/AMPK信號通路受到抑制。由此可見LRRK2對于PD發(fā)生過程中的線粒體功能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，且這種調(diào)節(jié)作用可能與CaMKK-β/AMPK通路相關(guān)。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型存在線粒體功能受損，而干擾LRRK2會使線粒體的功能得到恢復(fù)，CaMKK-β/AMPK信號通路與線粒體穩(wěn)態(tài)和PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而干擾LRRK2會抑制CaMKK-β/AMPK信號通路的激活，由此可見線粒體功能障礙是PD發(fā)生的重要原因之一，LRRK2在調(diào)節(jié)線粒體功能方面發(fā)揮著重要的作用，并可調(diào)節(jié)CaMKK-β/AMPK信號通路，這可能為PD發(fā)生機(jī)制研究及基于LRRK2的靶向藥物開發(fā)提供了新的參考依據(jù)。