復方中藥制劑對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經保護作用的研究

謝旭芳 胡建新 吳曉牧 任玥

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，具有易復發(fā)和致殘率高的特點，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1]。盡管針對MS治療的研究取得不斷進步，但目前MS仍然是一種無法治愈的慢性致殘性疾病。現(xiàn)有的各種治療藥物只能緩解癥狀，延緩病情發(fā)展，且均有一定的不良反應，藥物費用昂貴，需長期使用[2]。因此，尋求有效且副作用小的藥物具有重要意義。近年來，開展了許多針對中醫(yī)藥對CNS疾病的病因、病機、辨證治療的相關研究，結果表明中醫(yī)藥在神經免疫性疾病特別是MS防治方面具有潛在優(yōu)勢[3-4]。根據(jù)MS毒損督絡、戕害腎陽及腦髓、敗壞形體的病理機制理論，作者團隊自制中藥復方制劑，觀察了其對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的療效，并探討其機制，旨在為MS的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 動物SPF級雌性C57BL/6小鼠36只，8～12周齡，體重18～20 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司〔SCXK(湘)2016-0002〕。本動物實驗經江西省人民醫(yī)院倫理委員會審批備案。

1.2 主要試劑及儀器包括髓鞘少突細胞糖蛋白35-55(MOG35-55)肽段(T510219，上海生工)、完全福氏佐劑(F5881，SIGMA)、百日咳毒素(P7208，SIGMA)、蘇木素染液(AR11800-1，BOSTER)、神經組織固藍染色試劑盒(GMS80019.1 v.A，GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A)、小鼠白細胞介素-4(IL-4)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(m1002149，上海酶聯(lián))、小鼠γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒(m1002277，上海酶聯(lián))、小鼠IL-17A ELISA檢測試劑盒(m1037866，上海酶聯(lián))、BCA蛋白定量試劑盒(CW0014S，康為世紀)、鼠抗GAPDH單克隆抗體(TA-08，中杉金橋)、兔抗血清/糖皮質激素誘導的激酶-1(serum/glucocorticoid-inducible kinase-1，SGK-1)多克隆抗體(ab32374，Abcam)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金橋)、超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemi DocTM XRS+，伯樂)、顯微鏡(CX41，奧林巴斯)、酶標儀(RT-6100，Rayto)。

1.3 方法

1.3.1復方中藥制作：按一定比例稱取黃芪、紅花、茯苓、白芍、黃芩、青蒿、僵蠶、水蛭等原藥，采用水煎煮法獲取生藥提取液(2 g/mL)。具體步驟為：將生藥用水浸泡2 h后，重新加入6倍水量，煎煮1.5 h，獲得提取液，重復2次，將兩次提取液合并后用9號篩濾過，通過減壓蒸干濃縮至提取液中總生藥材濃度為2 g/mL，滅菌封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2EAE模型制備與評分：將溶于PBS的MOG35-55肽段(3 mg/mL)與等體積完全福氏佐劑(含結核桿菌1 mg/mL)充分混勻成油包水乳劑，于小鼠脊柱背側中線兩側分四點皮下注射(0.2 mL)，并于免疫當日和48 h后分別通過腹腔注射200 ng百日咳毒素，以進行免疫誘導制備EAE模型。自造模日起每日觀察臨床體征并進行神經功能評分，直至動物死亡或處死。根據(jù)Kono 5級評分法進行評分：0分，無任何臨床癥狀；1分，尾癱；2分，雙后肢無力；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢及部分前肢癱瘓；5分，完全四肢癱瘓或死亡。癥狀介于兩者之間記0.5分。出現(xiàn)癥狀即為發(fā)病。

1.3.3動物分組與給藥：將EAE小鼠隨機分為EAE模型組、中藥組、激素組，每組各12只。自造模后第14日起：EAE模型組每日給予生理鹽水0.2 mL灌胃；中藥組按體重20 g/kg(每只約 0.20±0.05mL)給予自制復方中藥灌胃；激素組按體重3.9 mg/kg給予醋酸潑尼松(溶于0.2 mL生理鹽水)灌胃治療，直至造模第42天結束。

1.3.4組織學染色：于EAE造模第27天，每組各取3只小鼠處死取脊髓組織，置4%(質量濃度)中性緩沖甲醛固定超過24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋并制成4 μm厚石蠟切片。每只小鼠隨機選取各兩張切片，分別進行HE和LFB髓鞘染色。置顯微鏡下觀察炎細胞浸潤及脫髓鞘病變情況并拍片。

1.3.5ELISA法檢測細胞因子水平：于EAE造模第20天、第27天和第42天，每組各6只小鼠取外周血清，采用ELISA法檢測血清IL-4、IL-17A和IFN-γ細胞因子水平，嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作。使用酶標儀在450 nm波長測量各樣品孔吸光度值，根據(jù)標準曲線計算各樣本細胞因子相對表達水平。

1.3.6Western blot：于EAE造模第27天和第42天，每組各取3只小鼠處死取腦脊髓組織，使用電動勻漿器低溫條件下勻漿，RIPA裂解液提取蛋白，BCA蛋白濃度分析試劑盒測定蛋白濃度。經10%(質量濃度)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將電泳產物轉移至NC膜上，加入兔抗SGK-1多克隆抗體及辣根酶標記山羊抗兔IgG，ECL法顯影。應用NIH Image J 1.41計算灰度值，結果以與內參的比值表示(以GAPDH為內參)SGK-1蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用K-S法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組EAE小鼠發(fā)病情況比較各組EAE小鼠發(fā)病時間、癥狀達峰時間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而神經功能評分峰值間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，中藥組及激素組EAE小鼠神經功能評分峰值較低(P<0.01)，而中藥組與激素組間比較無統(tǒng)計學差異 (P>0.05)。結果見表1。

表1 各組小鼠EAE發(fā)病情況比較

2.2 各組小鼠脊髓組織染色HE染色結果顯示，各組EAE小鼠疾病高峰期〔EAE造模第(27±1)天〕脊髓組織均出現(xiàn)不同程度炎細胞浸潤，其中中藥組和激素組炎細胞浸潤較模型組減輕；LFB染色結果顯示，各組小鼠均出現(xiàn)不同程度髓鞘密度下降，其中EAE模型組白質排列不整齊，有碎裂及空泡形成，提示發(fā)生脫髓鞘改變，而中藥組髓鞘脫失情況較輕微。結果見圖1。

注：EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎

2.3 各組小鼠外周血細胞因子水平與EAE模型組比較，中藥組和激素組EAE小鼠EAE病程前期、高峰期以及緩解期外周血IFN-γ和IL-17A水平均低(均P<0.01)，而IL-4水平均高(均P<0.01)；與激素組比較，中藥組小鼠不同EAE病程階段IFN-γ和IL-4水平比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，而IL-17A水平于EAE高峰期和緩解期低于激素組(均P<0.05)。結果見表2。

表2 各組EAE小鼠外周血細胞因子水平比較

2.4 各組小鼠CNS SGK-1蛋白表達EAE疾病高峰期和緩解期中藥組及激素組小鼠腦脊髓組織SGK-1蛋白表達均低于EAE模型組(均P<0.01)，且中藥組小鼠腦脊髓組織SGK-1蛋白表達低于激素組(P<0.01)。結果見圖2～3。

注：EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎；SGK-1：血清/糖皮質激素誘導激酶-1；A：疾病高峰期；B：疾病緩解期

注：EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎；SGK-1：血清/糖皮質激素誘導的激酶-1

3 討論

近年來研究結果顯示，中醫(yī)辨證施治MS可以緩解癥狀，減輕病情，調節(jié)和穩(wěn)定機體免疫功能，加速激素減量過程，同時還可在一定程度上減輕激素的副作用，中藥治療MS/EAE具有顯著療效[5-8]。本研究采用的復方中藥制劑是根據(jù)MS毒損督絡、戕害腎陽及腦髓、敗壞形體的病機理論將黃芪、紅花、茯苓、白芍、黃芩、青蒿、僵蠶、水蛭等按一定比例配制，具有益氣活血、健脾生津、清熱利濕、祛風通絡等功效。作者團隊既往研究證實，該復方中藥對免疫反應小鼠有治療作用[9]，且能夠明顯抑制小鼠免疫反應，且比單用雷公藤更有效[10]。本研究結果顯示，復方中藥可降低EAE小鼠神經功能評分及改善CNS組織炎性浸潤和脫髓鞘改變，進一步證實了該復方中藥對EAE小鼠具有神經保護作用。

研究結果顯示，CD4+T淋巴細胞介導的對自身髓鞘抗原產生的免疫應答為MS及EAE的可能發(fā)病機制，其中輔助性T細胞(helper T cells，Th)1和Th17的作用尤為重要[11]。Th1細胞分泌IFN-γ，Th17細胞分泌IL-17，這些細胞和炎性反應因子滲入CNS，破壞血-腦屏障，可導致大量的免疫細胞被募集到CNS。激活的免疫細胞產生大量的IL-12、IL-6、IL-7、IL-21和IL-23等炎性反應因子，破壞神經元和少突膠質細胞，造成局部脫髓鞘和軸索損傷[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，復方中藥干預組小鼠外周血炎性細胞因子IFN-γ明顯低于EAE模型組，前炎性細胞因子IL-17A低于模型組及激素治療組，而抑炎性細胞因子IL-4高于模型組，提示該復方中藥制劑可通過調節(jié)細胞因子水平從而發(fā)揮減輕EAE炎癥反應的作用。

該研究亦發(fā)現(xiàn)，中藥組EAE小鼠CNS組織SGK-1蛋白表達降低，提示SGK-1可能參與了該復方中藥對EAE免疫反應的調節(jié)過程。SGK-1是p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)下游蛋白，可被血清、醛固酮、高滲及氧化應激等多種應激刺激激活，發(fā)揮調控離子通道和信號轉導等多重作用，與T細胞免疫關系密切[13]。p38 MAPK信號通路在調控Th17細胞分泌IL-17的過程中起重要作用。有研究顯示在小鼠EAE模型炎性反應細胞和CNS膠質細胞中p38 MAPK磷酸化水平增加[12]，而應用p38 MAPK抑制劑干預的小鼠和基因敲除p38α的小鼠Th17細胞功能受損，EAE嚴重程度降低[14-15]。相反，在增加p38 MAPK活性的轉基因小鼠體內，T細胞連續(xù)特異性表達MAPK激酶6，促進了IL-17的分泌和加重了EAE的嚴重程度[14]。因此，p38 MAPK信號通路在MS/EAE的致病中發(fā)揮了重要作用。SGK-1是一種以滲透壓調節(jié)功能的蛋白激酶，既往在神經免疫研究領域極少被涉及，推測其可能作為聯(lián)系T細胞免疫和氧化應激的關鍵節(jié)點，通過p38MAPK-SGK1-Th17通路在MS及EAE中發(fā)揮重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)中藥干預組小鼠腦脊髓組織SGK-1表達明顯降低，同時外周血IL-17亦明顯低于EAE模型組及激素干預組，為該假說提供了研究證據(jù)。

綜上所述，該復方中藥能夠通過調節(jié)細胞因子水平抑制EAE免疫反應，促進EAE模型小鼠神經功能損傷的恢復，其免疫反應的調控作用機制可能與p38MAPK-SGK1信號通路關系密切，但具體作用機制尚仍需進一步探索。深入研究復方中藥對EAE的作用可為MS的藥物治療、靶向治療提供新思路。