響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖固定果膠酸裂解酶的研究

郁桂聰鄭豪蕾王曉倩何致民高 娟

(濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250022)

0 引言

果膠是一類結(jié)構(gòu)不均一的多糖,廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁的中間層。果膠主要由半乳糖醛酸(Gal A)通過α-1,4-糖苷鍵連接而成[1],包括聚半乳糖醛酸(HG)、聚鼠李半乳糖醛酸-I(RG-I)和聚鼠李半乳糖醛酸-II(RG-II)三種結(jié)構(gòu)域單元[2,3]。果膠在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)等工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用[4,5]。近年來的研究表明,果膠的降解產(chǎn)物具有良好的理化性質(zhì),作為食品添加劑,藥物和化妝品材料具有廣闊的應(yīng)用前景[6,7]。

果膠的降解需要一系列果膠酶的協(xié)同作用。根據(jù)催化機(jī)制不同,果膠酶可分為三類:果膠解聚酶、果膠酯酶和果膠裂解酶[8,9]。其中,果膠酸裂解酶(Pectate lyase,PL,EC 4.2.2.2)斷裂果膠HG 結(jié)構(gòu)域中的α-1,4-糖苷鍵,從C-5位消去一個H 原子,在非還原端產(chǎn)生含有不飽和半乳糖醛酸殘基的寡聚糖[10]。不同來源的果膠酸裂解酶對酸堿耐受性不同。由于果膠在堿性溶液中顯示出更好的溶解性,因此堿性果膠酸裂解酶展現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景[11,12]。

果膠酸裂解酶被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),如果蔬汁的萃取與純化、苧麻纖維脫膠、果膠廢水的處理等領(lǐng)域[13,14]。迄今為止,果膠酸裂解酶已經(jīng)從各種微生物中分離出來。芽孢桿菌屬細(xì)菌是微生物果膠裂解酶的主要來源之一[15,16]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明,多粘類芽孢桿菌的基因組中含有4個果膠酸裂解酶編碼基因。對多粘類芽孢桿菌的果膠酸裂解酶Pp Pel10a的研究表明:該酶能夠有效降解柑橘果膠,產(chǎn)物主要為不飽和的單半乳糖醛酸和低聚半乳糖醛酸。Pp Pel10a單獨(dú)處理或Pp Pel10a-氫氧化鈉聯(lián)合處理苧麻纖維,苧麻纖維失重明顯[17]。因此,該酶在果汁澄清和植物纖維加工中有潛在的應(yīng)用前景。但是,PpPel10a的酶活和穩(wěn)定性易受外界因素如堿性p H 和高溫的影響,不利于其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

固定化可以提高酶的使用效率和穩(wěn)定性,并能降低酶的應(yīng)用成本[18],為提高果膠酸裂解酶的穩(wěn)定性提供了可能的解決途徑[19]。戊二醛交聯(lián)法是一種比較常用的酶固定化方法。交聯(lián)劑的選擇及交聯(lián)條件對固定化酶的回收率和穩(wěn)定性影響較大[20,21]。因此,在本研究中,利用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)對殼聚糖交聯(lián)固定Pp Pel10a的條件展開優(yōu)化,并利用固定化Pp Pel10a進(jìn)行苧麻纖維脫膠實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組果膠酸裂解酶(Pp Pel10a):本實(shí)驗(yàn)室從多粘類芽孢桿菌中克隆并在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達(dá)[17];苧麻韌皮購自淘寶;多聚半乳糖醛酸(PGA)購買自上海源葉生物;50%戊二醛:天津市大茂化學(xué)試劑廠;其它試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白含量測定。以牛血清白蛋白(25～500μg/m L)為標(biāo)準(zhǔn)品,利用BCA 法繪制蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.8149x＋0.2247(R2＝0.9954,x軸為BSA 的濃度,mg/m L;y軸為A562)計算游離酶和固定化酶的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 固定化PpPel10a的制備。將3 g殼聚糖溶于100 m L的2%乙酸溶液中制備成3%的殼聚糖溶液,用1 m L注射器吸取該溶液滴入乙醇:NaOH 溶液(1:4,v:v)中,4 ℃條件下硬化4 h。然后用去離子水沖洗殼聚糖小球,直至呈p H 中性,抽濾干燥。置入10 m L 3%戊二醛中,25℃振蕩交聯(lián)過夜。稱取0.1 g殼聚糖小球載體,加入0.6 mg純化的重組Pp Pel10a,30℃振蕩吸附3 h,然后4℃靜置14 h,去離子水洗滌,抽濾干燥后即得固定化酶,4 ℃儲存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 果膠酸裂解酶活性測定。將0.7μg純化酶或0.1 g固定化酶小球加入到2 m L 含有0.2%PGA 的Gly-NaOH 緩沖液中(50 mmol/L,p H 9.0),50 ℃反應(yīng)15 min后,測定235 nm 處的吸光度。1 個酶活單位(U)定義為在上述條件下,每分鐘使235 nm 波長處吸光度增加0.01所需的酶量[22]。固定化酶的酶活回收率＝(酶總活力-游離酶活力)/酶總活力×100%。

1.3.4 固定化條件優(yōu)化。

(1)單因素試驗(yàn)。通過控制變量確定各因素對固定化效果的影響。變量設(shè)置條件:殼聚糖濃度分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%;戊二醛濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%;游離酶添加量:每0.1 g殼聚糖小球分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg純化的重組Pp Pel10a;吸附時間:1、2、3、4、5、6 h;吸附溫度:10、15、20、25、30、35、40 ℃。固定化方法如1.2.2所示。

(2)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Plackett-Burman試驗(yàn)確定影響固定化效率的主要因素。利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計N＝12的5因素2水平的Plackett-Burman試驗(yàn)[23],各因素的編碼水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平編碼表

(3)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出三個影響酶活的顯著因素,設(shè)計這三個因素的最陡爬坡路徑,爬坡方向根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)值變化的梯度方向確定[24]。

2.廣泛調(diào)查測評對象。一是調(diào)查企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營與科技創(chuàng)新計劃，分析出企業(yè)急需解決的問題，把握培訓(xùn)需求；二是從企業(yè)各部門了解和搜集生產(chǎn)、安全、成本等有關(guān)數(shù)據(jù)及情況，從中發(fā)現(xiàn)哪些需要人才開發(fā)的支持；三是對企業(yè)和職工進(jìn)行調(diào)查，從中確定需要哪種培訓(xùn)；四是對全體參加培訓(xùn)的職工，了解他們對培訓(xùn)的內(nèi)容、培訓(xùn)形式、培訓(xùn)技巧等有哪些基本的要求，使培訓(xùn)的需求調(diào)查得到可靠的結(jié)論。

(4)響應(yīng)面分析優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0設(shè)計Box-Behnken實(shí)驗(yàn)[25],響應(yīng)面水平見表2。使用MINITAB 16.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析[26]。

表2 響應(yīng)面各因素及水平

(5)最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)。按照響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到最優(yōu)的Pp Pel10a固定條件進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證,按照1.2.3的方法測定固定化Pp Pel10a的酶活,取平均值與預(yù)測值比較。

1.3.5 固定化酶和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較。(1)最適p H 測定。將游離酶或固定化酶在p H 2.0～11.0的緩沖液中,加入PGA 底物后,50 ℃反應(yīng),按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。所用緩沖液為:Na AC緩沖液(50 mmol/L,p H 2.0～6.0),磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L,p H 6.0～8.0),Gly-NaOH 緩沖液(50 mmol/L,p H 8.0～11.0)。(2)p H 穩(wěn)定性測定。將游離酶和固定化酶分別置于p H 2.0～11.0的緩沖液中,室溫放置20 h,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。所用緩沖液如1.2.5.1所示。(3)最適溫度測定。將游離酶和固定化酶置于20～80 ℃,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。以最高的酶活力定義為100%。(4)溫度穩(wěn)定性測定。將游離酶和固定化酶分別置于60、70 ℃水浴鍋中保溫60 min,在此期間間隔取樣,按照1.2.3的方法分別測定游離酶和固定化酶的酶活。未保溫測定的酶活記為100%。(5)操作穩(wěn)定性。將固定化酶按照1.2.3的方法連續(xù)操作10次,測定相對酶活。以第一次的酶活定義為100%。

1.4 固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維

稱取2.0 g苧麻纖維,水煮10 min,分別用以下方法處理。陰性對照:50 mmol/L甘氨酸-Na OH 緩沖液(p H 9.0);酶法:固定化Pp Pel10a微球0.5 g。各實(shí)驗(yàn)組在50℃、100 r/min條件下振蕩反應(yīng)4 h。處理后的樣品用去離子水清洗,干燥后失重,記錄損失重量,并用SEM 觀察苧麻纖維的表面。苧麻脫膠的失重率(%)＝苧麻損失重量/原苧麻重量?100%[27,28]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并用SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 殼聚糖濃度對固定化Pp Pel10a效果的影響。殼聚糖的濃度對固定化酶的酶活回收率至關(guān)重要。如圖1所示,在2%～3%范圍內(nèi),隨著殼聚糖濃度增加,固定化PpPel10a的酶活逐步升高,在3%濃度時酶活最高。隨著殼聚糖濃度繼續(xù)升高,Pp Pel10a酶活大幅下降。推測是由于殼聚糖濃度低于3%時,殼聚糖小球呈橢圓形,球表膜機(jī)械強(qiáng)度差,易形變。而殼聚糖濃度大于3%時,殼聚糖小球出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,剛性過強(qiáng),易碎。在殼聚糖濃度為3%時,殼聚糖小球呈規(guī)則圓球形,機(jī)械強(qiáng)度良好,不易形變。因此,殼聚糖的濃度影響固定化小球的形狀和機(jī)械強(qiáng)度從而對固定化酶的酶活回收率產(chǎn)生影響。

圖1 殼聚糖濃度對固定化酶活性的影響

2.1.2 戊二醛濃度對固定化Pp Pel10a效果的影響。戊二醛作為一種雙官能團(tuán)交聯(lián)劑,對蛋白質(zhì)的交聯(lián)效果較好。戊二醛濃度對固定化酶活性的影響見圖2。當(dāng)戊二醛濃度小于4%時,固定化效果隨著戊二醛濃度增加而提高,高于4%濃度的戊二醛使固定化效果開始下降。原因可能是高濃度戊二醛導(dǎo)致Pp Pel10a變性失活,另一種原因可能是戊二醛濃度過高時,造成小球表面孔隙過大,導(dǎo)致固定化酶容易流失,造成固定化效果下降。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響

2.1.3 游離酶添加量對固定化PpPel10a效果的影響。游離酶添加量對固定化酶活性的影響見圖3。當(dāng)添加量在2～8 mg·g－1范圍內(nèi),固定化效果隨著酶量增加而提高,固定化效果顯著上升。當(dāng)添加量在大于8 mg·g－1時,此時載體上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和,從而導(dǎo)致酶分子的相互聚集,使得固定化效果下降。

圖3 酶濃度對固定化酶活性的影響

2.1.4 吸附時間對固定化Pp Pel10a效果的影響。吸附時間對固定化酶活性的影響見圖4。吸附時間為5 h時固定化效果最好,從5 h開始出現(xiàn)下降趨勢。分析原因可能是時間過長導(dǎo)致酶失活;另一個原因可能是已經(jīng)固定化的酶向外擴(kuò)散,造成酶量減少,使固定化效果降低。

圖4 吸附時間對固定化酶活性的影響

2.1.5 吸附溫度對固定化Pp Pel10a效果的影響。吸附溫度一方面影響吸附效率,另一方面影響酶的穩(wěn)定性。由圖5可知,吸附溫度在30 ℃時固定化Pp Pel10a的酶活最高,高于或低于30℃導(dǎo)致Pp Pel10a的固定化效果較差。

圖5 吸附溫度對固定化酶活性的影響

2.2 固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計篩選顯著影響因素。根據(jù)表1實(shí)驗(yàn)因素的水平,使用Design-Expert 8.0設(shè)計N＝12的5因素2水平Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證上述五種因素對固定化效果影響是否顯著。酶活結(jié)果及各因素的顯著性水平分別見表3和表4。由結(jié)果可知?dú)ぞ厶菨舛?、戊二醛濃度以及游離酶添加量這三項(xiàng)因素對Pp Pel10a固定化的酶活影響較大(P＜0.05),接下來對這三個因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 Plackeet-Burman試驗(yàn)設(shè)計的因素水平及效應(yīng)分析

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)。分析表4的PB試驗(yàn)結(jié)果可知,殼聚糖濃度和游離酶添加量的T 值為正值,顯示這兩個因素對PpPel10a的固定化具有正效應(yīng),按遞增模式設(shè)計爬坡路徑;戊二醛濃度的T 值為負(fù)值,表明其對Pp Pel10a的固定化具有負(fù)效應(yīng),按遞減模式設(shè)計(表5)。由最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果可知,第3組為最佳因子組合,實(shí)驗(yàn)條件為:殼聚糖濃度(X1)3.5%,戊二醛濃度(X2)3%,游離酶添加量(X3)為8 mg·g－1。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固定化條件。(1)Box-Behnken試驗(yàn)。根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以殼聚糖濃度、戊二醛濃度、游離酶添加量三者為自變量,PL酶活為響應(yīng)值,設(shè)計N＝17的3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)。PL酶活結(jié)果如表6所示。(2)回歸方程的建立及顯著性。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)Design-Expert 8.0軟件分析,確定影響固定化效果的二次回歸方程:PL 酶活(U·mg－1)＝6716.18 ＋22.63X1－36.90X2＋274.63X3－195.25X1X2＋878.55X1X3－ 254.75X2X3－ 1117.62X12－ 441.42X22－ 1100.96X32。其中X1、X2和X3分別代表殼聚糖濃度、戊二醛濃度和游離酶添加量的編碼水平。回歸方程方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明:該模型的P值＜0.01(P＝0.0002),失擬項(xiàng)的P值＞0.05(P＝0.0877),說明該的模型失擬不顯著,回歸顯著,能夠用來對固定化酶的酶活性進(jìn)行預(yù)測。一次項(xiàng)X3、二次項(xiàng)X22與交互項(xiàng)X2X3對固定化酶活性影響顯著,二次項(xiàng)X12、X32與交互項(xiàng)X1X3對固定化酶活性影響極顯著。其余均不顯著?；貧w模型的決定系數(shù)為0.9696,說明該模型很好地反應(yīng)了固定化酶的酶活與殼聚糖濃度、戊二醛濃度和游離酶添加量之間的關(guān)系,且實(shí)驗(yàn)誤差較小,并具有良好的擬合程度。(3)響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件確定。利用Design-Expert 8.0繪制響應(yīng)面分析圖(圖6)。由響應(yīng)面圖可以看出:殼聚糖濃度(X1)、戊二醛濃度(X2)、游離酶添加量(X3)三個因素兩兩之間存在交互作用。結(jié)合各因素交互作用對固定化酶活性影響的響應(yīng)面圖和回歸模型,當(dāng)殼聚糖濃度(X1)、戊二醛濃度(X2)、游離酶添加量(X3)分別為3.5%、3%、8 mg·g－1時,預(yù)測固定化效果達(dá)到最佳,其PL酶活響應(yīng)值為6733.3 U·mg－1。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表7 二次方模型響應(yīng)面方差分析

圖6 各因素交互作用影響果膠酸裂解酶固定化的響應(yīng)面圖

利用分析得出的最佳條件因素進(jìn)行模型驗(yàn)證,三次平行實(shí)驗(yàn)得到酶活數(shù)值分別為6685.7、6742.9、6761.9 U·mg－1,與理論值6733.3 U·mg－1相比偏差極小,表明該模型可信度高。在此條件下,計算固定化Pp Pel10a的酶活回收率為87.3%。

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適p H 與p H 穩(wěn)定性。游離狀態(tài)下,PpPel10a的最適p H 為9.0,經(jīng)過固定化后,PpPel10a的最適p H 遷移到10.0(圖7)。堿性果膠酸裂解酶適用于果膠質(zhì)的降解,具有較好的應(yīng)用價值。

圖7 固定化酶與游離酶的最適p H 結(jié)果

將固定化酶和游離酶放置于不同p H 緩沖液中孵育24 h后,測定其酶活力,結(jié)果如圖8所示。當(dāng)p H 值達(dá)到11.0時,固定化酶的殘留活性仍能達(dá)到70%,而游離酶活性僅殘留50%左右,說明經(jīng)過固定化后,提高了游離的PpPel10a在近堿性條件下的作用效果。

圖8 固定化酶與游離酶的p H 穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.2 最適溫度與溫度穩(wěn)定性。如圖9所示,固定化PpPel10a與游離狀態(tài)的PpPel10a的最適反應(yīng)溫度均為50℃。超過50℃后,二者的相對酶活性均隨溫度的提高而降低,在同一溫度下,固定化PpPel10a的酶活均高于游離酶。

圖9 固定化酶與游離酶的最適溫度測定

將固定化酶與游離酶置于60 ℃或70 ℃下孵育一段時間,檢測其殘余活性。如圖10所示,70 ℃條件下孵育1 h,游離酶僅剩約20%的酶活,但固定化酶的酶活仍保留70%以上。此外,在同一溫度下,固定化酶的相對酶活力較游離酶下降的慢。綜上所述,固定化PpPel10a的熱穩(wěn)定性較游離酶有所提高。

圖10 固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性

2.3.3 操作穩(wěn)定性。固定化酶的使用次數(shù)反映其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力?？芍貜?fù)使用次數(shù)越多,該酶的應(yīng)用潛力越大。如圖11所示,隨著使用次數(shù)的增加,固定化Pp Pel10a的酶活逐步降低。重復(fù)使用7次后,PpPel10a的酶活仍殘留30%以上,這表明殼聚糖固定化后的PpPel10a重復(fù)利用率較高。

圖11 固定化酶的操作穩(wěn)定性測定

2.4 固定化PpPel10a處理苧麻纖維

果膠酸裂解酶可用于苧麻纖維的脫膠過程。前期研究表明,游離的Pp Pel10a在苧麻纖維脫膠過程中發(fā)揮了良好的作用。但因?yàn)槠r麻纖維脫膠過程一般在堿性條件下進(jìn)行,對果膠酸裂解酶的p H 穩(wěn)定性要求較高,游離酶無法滿足這一需求。在此,利用固定化PpPel10a進(jìn)行苧麻纖維脫膠。與對照組相比,固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維后,苧麻重量損失達(dá)20.2% ±2.3%,遠(yuǎn)高于對照組(10.1% ±0.9%)。脫膠后的苧麻纖維形態(tài)觀察表明固定化酶處理比單獨(dú)緩沖液處理,苧麻纖維更加柔軟、潔白(圖12(a、b)),SEM 掃描發(fā)現(xiàn)表面更加光滑(圖12(c、d)),說明該固定化酶在苧麻纖維脫膠中具有潛在的應(yīng)用價值。

圖12 固定化PpPel10a處理苧麻纖維(a)對照組苧麻纖維形態(tài);(b)固定化PpPel10a處理后的苧麻纖維后形態(tài);(c)苧麻纖維SEM 掃描;(d)SEM 掃描觀察固定化PpPel10a處理的苧麻纖維;SEM 放大倍數(shù)為500

3 結(jié)論

殼聚糖是一種幾丁質(zhì)脫乙酰產(chǎn)物,在食品行業(yè)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用,具有較高的安全性和蛋白吸附能力。因此本文采用殼聚糖作為固定化酶載體,并通過實(shí)驗(yàn)測得固定化果膠酸裂解酶Pp Pel10a的最優(yōu)條件為:殼聚糖濃度3.5%、戊二醛濃度3%、酶濃度8 mg·g－1、吸附時間5 h、吸附溫度30 ℃。在此優(yōu)化條件下固定化酶PpPel10a的酶活回收率為87.3%。固定化PpPel10a較游離酶相比,最適p H 向堿性p H 偏移,且固定化后的Pp Pel10a的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性較游離酶相比均有所提高。固定化酶重復(fù)使用7次后殘留酶活力仍有30%,說明該酶具有較好的工業(yè)生產(chǎn)潛力。利用固定化Pp Pel10a處理苧麻纖維,通過電子顯微鏡掃描發(fā)現(xiàn),酶處理獲得的纖維表面更加平滑且纖維分散度較高。本研究為固定化果膠酸裂解酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。