一種改良機(jī)械性牽拉血管痙攣模型的建立

馬啟明，曹晨曦，陳紹鋒，謝昀

1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，福州 350108；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福州 350005

上世紀(jì)七十年代，我國創(chuàng)用游離皮瓣獲得成功，成為顯微外科發(fā)展史上的重要里程碑[1]。隨著顯微外科技術(shù)的進(jìn)步，血管吻合通暢率達(dá)92.7%[2]，血管組織移植已成為重建手術(shù)的常規(guī)方法。但是，與血管痙攣和血栓形成相關(guān)的移植物壞死在很大程度上超出了技術(shù)控制范圍，其發(fā)生率占所有顯微手術(shù)的5%～10%[3]。對于重建手術(shù)后血管痙攣的定義為由病理刺激引起的血管平滑肌局部而持續(xù)性的痙攣，這與全身性的血管痙攣完全不同，后者大多是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)通路引起，是一種廣泛的血管痙攣，而重建手術(shù)后的血管痙攣受中樞影響極小，幾乎是局部血管痙攣[4,5]。造成血管痙攣的機(jī)制極其復(fù)雜，可由眾多因素誘發(fā)，包括直接操縱血管、血管代謝失衡和內(nèi)環(huán)境改變。對于顯微外科醫(yī)師而言，術(shù)中血管痙攣很常見，尤其是對微小血管進(jìn)行操作時，更易誘發(fā)機(jī)械性血管痙攣，因此對血管痙攣的深入研究意義重大[6]。在臨床條件下研究血管痙攣難度較大，可能給患者帶來損傷。多數(shù)學(xué)者選擇動物模型進(jìn)行相關(guān)研究?，F(xiàn)有的血管痙攣模型中，如腎上腺素誘發(fā)模型[7]、內(nèi)皮素誘發(fā)模型和氯化鉀誘發(fā)模型[8]，此類模型均為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型，其具有較高的建模成功率及穩(wěn)定性，但不能完全模擬重建手術(shù)中的血管痙攣。Hy?a等[9]創(chuàng)建機(jī)械牽拉血管模型，使用縫線一端連接皮瓣血管蒂部，另一端由砝碼提供牽拉力，以此誘發(fā)機(jī)械性血管痙攣，但其模型不能保證受牽拉的目標(biāo)血管受力均勻，造成模型的不穩(wěn)定以及血管痙攣程度不一。此外，由于動脈和靜脈被牽拉后，二者血管生理狀態(tài)表現(xiàn)不同步，而動脈灌注對血管組織移植影響較靜脈大[10]。故本研究僅對動脈痙攣進(jìn)行觀測。本文目的是建立一個機(jī)械性牽拉誘發(fā)的動脈痙攣模型，以模擬重建手術(shù)中操作刺激誘發(fā)的動脈痙攣。后續(xù)將在此模型上進(jìn)行解除痙攣藥物的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

使用48只Sprague-Dawley成年雄性大鼠，體重（300±25）g。實驗動物來源于福建醫(yī)科大學(xué)動物中心，該實驗得到福建醫(yī)科大學(xué)實驗倫理委員會批準(zhǔn)，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行（溫度25℃；合適光照；無菌操作），實驗中使用的藥物由福建醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 解剖血管 使用2%戊巴比妥麻醉大鼠，劑量為40 mg/kg，腹股溝部備皮，消毒鋪巾，由大腿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)向腹股溝部小心快速地切開表層皮膚，暴露大鼠股動、靜脈。在顯微鏡下游離股動靜鞘長度1 cm，從游離段下方兩端穿過4-0手術(shù)縫線（圖1A）。目標(biāo)血管兩端的縫線均與肌張力換能器相連，該裝置可以調(diào)整血管兩端所受的拉力大?。▓D1B）。在解剖血管鞘過程中，不可牽拉和擠壓血管，以防誘發(fā)嚴(yán)重的血管痙攣。所有手術(shù)操作由同一位實驗人員完成。

圖1 實驗操作流程圖A：在血管下方兩端穿過手術(shù)縫線，調(diào)整手術(shù)縫線致其力的方向與血管軸向平行，該線僅套住血管但不打結(jié) B：線兩端分別通過定向滑輪（紅色箭頭）與肌張力換能器（黃色箭頭）連接，肌張力換能器連接生物信號采集系統(tǒng)，可在計算機(jī)上實時顯示拉力大小Fig.1 Flow chart of experimental operationA:Surgical suture lines were used at both ends of the vessel.Adjusted the direction of the sutures to be parallel to the axial direction of the blood vessel;B:The line only trapped the blood vessels but did not tie.The two ends of the line were connected to the tension transducer through a directional pulley.The muscle tension transducer was connected to the biological signal acquisition system,which could display the tension size on the computer in real time,yellow arrow referred to muscletension transducer,red arrow referred to pulley

1.2.2 分組與建模 將解剖好的大鼠放在激光散斑血流成像儀（laser speckle contrast imaging，LSCI）的操作平臺上，使大鼠的股動靜脈清晰暴露在視野正中部。由于解剖操作可能誘發(fā)痙攣，所以把解剖后的大鼠靜置在操作臺上，使其恢復(fù)生理狀態(tài)的血管灌注。30 min后，記錄股動脈灌注值，作為基礎(chǔ)灌注值。在1～5組進(jìn)行如下操作：使用肌張力換能器分別施加拉力5、10、15、20、25 g（表1），5 min后撤銷拉力并記錄股動脈灌注值作為痙攣值。在LSCI平臺上實時監(jiān)測股動脈灌注。把拉力撤銷時間記為0（min），實驗的每個步驟按照設(shè)定的時間進(jìn)行（表2）。第6組進(jìn)行重建手術(shù)，使用顯微鑷子鈍性剝離目標(biāo)區(qū)域的股動脈鞘。

表1 實驗分組及刺激方式Tab.1 Experimental grouping and stimulation

表2 實驗步驟設(shè)計及定義Tab.2 Design and definition of experimental procedure

1.2.3 激光散斑血流成像儀實時監(jiān)測 調(diào)整LSCI至顯像清晰。設(shè)置LSCI自動拍照功能，每10 s拍照保存，通過其內(nèi)置系統(tǒng)，實時監(jiān)測血管的平均血流灌注（ROI）。對特定大小的目標(biāo)血管進(jìn)行區(qū)域選定，并測量選定區(qū)域ROI值。所有組別選定區(qū)域的大小一致（圖2）。

圖2 血流灌注監(jiān)測示意圖LSCI僅測量選定區(qū)域內(nèi)平均灌注量（ROI），各組別ROI測量區(qū)域大小一致Fig.2 Aschematic of theperfusionLSCI only measured the average perfusion volume(ROI)in the selected area,and the ROI measurement area of each group was consistent

1.2.3 數(shù)據(jù)采集 Hy?a等[11]對血管痙攣參數(shù)的設(shè)定被廣泛認(rèn)同。因此，參考其研究對數(shù)據(jù)進(jìn)行如下設(shè)定（圖3）：（1）痙攣臨界值＝痙攣后的灌注值+10%（基礎(chǔ)灌注值－痙攣時灌注值），血流灌注在痙攣臨界值以下被認(rèn)為處于血管痙攣狀態(tài)，而血流灌注恢復(fù)到痙攣臨界值時則被認(rèn)為血管痙攣已經(jīng)解除，所需時間記錄為T1；（2）血管痙攣后恢復(fù)到基礎(chǔ)灌注L2時，即超灌注狀態(tài)，所需時間記錄為T2。

圖3 血管痙攣參數(shù)設(shè)定圖T1為痙攣持續(xù)時間T2為超灌注所需時間L0為痙攣后的灌注L1為痙攣臨界值，其為痙攣狀態(tài)解除標(biāo)志L2為基礎(chǔ)灌注值，其為超灌注狀態(tài)標(biāo)志Fig.3 Vasospasm parameter mappingParameters of vasospasm were set:T1 was the duration of spasm;T2 was the time required for overperfusion;L0 was perfusion after convulsion;L1 was the critical value of spasm,which was the relief indicator of spasticity;L2 was the baseline perfusion value,which wasthehyperperfusion status indicator

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對各組血管痙攣持續(xù)時間和超灌注時間進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析，結(jié)果以（Mean±SEM）表示。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗兩類時間參數(shù)組間差異，LSD檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Graphpad Prism 5.0軟件對各組血管灌注與時間進(jìn)行做圖分析，以時間為橫坐標(biāo)、血流灌注為縱坐標(biāo)構(gòu)建XY二維圖。

2 結(jié)果

各組大鼠的持續(xù)痙攣時間、超灌注時間及動脈痙攣強(qiáng)度等見表3。在雙軸力25 g組中有6只大鼠動脈痙攣后無法恢復(fù)，可能因拉力過大，導(dǎo)致血管解剖結(jié)構(gòu)的變化，如內(nèi)皮或其它結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，僅有兩只大鼠緩慢恢復(fù)灌注，排除對該組的統(tǒng)計分析。其余4組牽拉組（拉力5、10、15、20 g）進(jìn)一步與對照組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。

表3 不同刺激組別分類及血管痙攣強(qiáng)度評估Tab.3 Classification of different stimulusgroupsand evaluation of vasospasm intensity

牽拉組（5、10、15和20 g）與對照組的痙攣持續(xù)時間、超灌注時間和過度超灌注時間進(jìn)行比較（表4）：（1）就痙攣持續(xù)時間而言，牽拉5 g和10 g組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；牽拉15 g組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.801）；而牽拉20 g組與血管剝離組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.041）；牽拉15 g組分別與牽拉10 g組和牽拉20 g組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001；P=0.025）。（2）就達(dá)到超灌注時間而言，牽拉5 g和10 g組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；牽拉15 g組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.629）；牽拉20 g組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.081）；牽拉15 g組與牽拉20 g組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.199）；其余組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

表4 單因素方差分析檢測各組的痙攣持續(xù)時間、超灌注時間Tab.4 The spasm duration and hyperperfusion time of each group were analyzed by single factor analysis of variance

3 討論

重建手術(shù)在顯微外科中扮演重要角色，如斷肢再植[12]、游離皮瓣移植[13]和腫瘤切除術(shù)后缺損部位相關(guān)性移植[14]等，此類操作大多涉及血管吻合。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，顯微技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，但血管吻合后的血運重建仍是移植物存活的關(guān)鍵因素。重建術(shù)后，血管痙攣的出現(xiàn)將導(dǎo)致移植組織的血流量減少，血液局部淤滯或血栓形成，最終可能發(fā)生大面積的移植物壞死。血管痙攣由眾多因素誘發(fā)，包括直接操縱血管、血管代謝失衡和內(nèi)環(huán)境改變，目前尚不清楚其具體機(jī)制[15]。因此解除血管痙攣成為手術(shù)過程中至關(guān)重要的因素?；A(chǔ)研究與臨床密不可分，高度模擬重建手術(shù)的血管痙攣模型的建立，可為解決臨床問題帶來新的思路。

目前可供研究的血管痙攣模型大致分為兩類，即神經(jīng)源性血管痙攣模型[16]和肌源性血管痙攣模型[17]。神經(jīng)源性血管痙攣模型包括去甲腎上腺素、5-羥色胺、內(nèi)皮素和氯化鉀溶液等局部應(yīng)用誘發(fā)痙攣[18]。而肌源性血管痙攣模型包括血管剝離和機(jī)械單軸力牽拉[11]誘發(fā)的痙攣。諸如此類的模型均有其自身局限性。如該4種神經(jīng)源性血管痙攣模型，僅模擬了移植術(shù)后的生理性血管活性物質(zhì)的改變，未涉及手術(shù)操作對血管痙攣的影響。血管剝離能很好地模擬重建手術(shù)誘發(fā)的血管痙攣，但由于血管剝離操作人為干擾較大，受顯微技術(shù)等原因影響，導(dǎo)致無法定量，所以剝離模型并不適合作為血管痙攣模型進(jìn)行研究。機(jī)械單軸力牽拉誘發(fā)的血管痙攣模型可以定量[11]，研究者使用縫線一端牽拉皮瓣蒂部血管，一端連接相應(yīng)重量的砝碼造成痙攣模型，但血管吻合口是受到斷口兩端的軸向力，即雙軸力，因此也不可完全模擬臨床重建操作。本研究把血管剝離作為對照組，血管雙向機(jī)械牽拉力為實驗組，力求建立能高度擬合臨床的定量血管痙攣模型。此外采用LSCI監(jiān)測目標(biāo)血管灌注，有以下優(yōu)點：（1）監(jiān)測探頭放置在目標(biāo)血管上方，避免直接接觸血管；（2）無需手術(shù)分離血管束即可同時監(jiān)測動脈和靜脈，避免了操縱性痙攣；（3）可以實時、精確和連續(xù)地監(jiān)測目標(biāo)血管平均灌注。LCSI的采用使研究獲得更高的數(shù)據(jù)采集質(zhì)量。

本研究致力于設(shè)計一個既可定量亦可高度模擬重建術(shù)后的血管痙攣模型。使用肌張力換能器作為雙軸力的牽拉裝置，縫牽拉線綁在目標(biāo)血管兩端；通過調(diào)節(jié)螺旋按鈕來調(diào)節(jié)牽拉力的大小，使目標(biāo)血管受到均勻的雙軸向牽拉而誘發(fā)血管痙攣。研究顯示，雙軸向牽拉力與血管痙攣程度關(guān)系密切（表3）。牽拉5 g和10 g組由于其力量較小，其血管痙攣持續(xù)時間與血管剝離組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；此二組達(dá)到超灌注的時間也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于血管剝離組（P＜0.001），由此說明牽拉5 g和10 g組誘發(fā)的血管痙攣程度不足，難以模擬重建手術(shù)中的血管痙攣。最大牽拉力25 g組在實驗中致使血管無法恢復(fù)血流灌注，可能是由于牽拉力過大，導(dǎo)致血管的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而血流灌注難以恢復(fù)。本研究組認(rèn)為牽拉力25 g超過血管痙攣范疇，不適合后續(xù)研究。牽拉15 g組和牽拉20 g組較為相似，二組在超灌注時間比較中無明顯差異（P=0.199），但在血管痙攣持續(xù)時間比較中，前者痙攣程度明顯低于后者（P=0.025）。此二組分別與對照組比較發(fā)現(xiàn)：牽拉15 g組在痙攣持續(xù)時間和超灌注時間與對照組無明顯差異（P=0.801；P=0.629），說明雙軸力牽拉15 g誘發(fā)的血管痙攣與重建手術(shù)中的血管剝離具有高度相似性，前者可以模擬臨床操作誘發(fā)的血管痙攣；牽拉20 g組與對照組比較，痙攣持續(xù)時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014），但超灌注時間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.081），說明20 g組與臨床操作所誘發(fā)的血管痙攣有部分相似性，但不足以模擬臨床血管痙攣。本研究結(jié)果與Hy?a[9]相似，其通過創(chuàng)建機(jī)械性牽拉皮瓣蒂血管痙攣模型發(fā)現(xiàn)，單軸向拉力15 g能較好地模擬皮瓣術(shù)后的血管痙攣，但其使用激光多普勒血流儀監(jiān)測血流灌注量，僅能監(jiān)測部分皮瓣血流量，不能監(jiān)測目標(biāo)血管灌注，此為研究的局限性。本研究使用無創(chuàng)的監(jiān)測工具LSCI，能實時反映血管的痙攣情況和動態(tài)高精度地觀察血管灌注，但LSCI作為一種激光檢測工具，對實驗環(huán)境要求較高，易受噪音和光照影響。

綜上所述，雙軸力牽拉15 g組在血管痙攣持續(xù)時間和超灌注時間與血管剝離誘發(fā)的血管痙攣無明顯差異，可以高度模擬臨床操作中的動脈痙攣。本研究建立的機(jī)械性雙軸牽拉力15 g血管痙攣模型可以作為一種新的血管痙攣模型，并可在此模型上進(jìn)行解痙藥物的篩選或開發(fā)。