缺氧誘導(dǎo)因子1-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-Notch信號(hào)通路參與馬蹄內(nèi)翻足畸形的發(fā)生機(jī)制

張真翊，陳曦，王謙

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，沈陽(yáng) 110122；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組教研室，沈陽(yáng) 110122

先天性馬蹄內(nèi)翻足（congenital talipes equinovarus，CTEV）主要表現(xiàn)為患兒出生后逐漸出現(xiàn)足跟下垂及足內(nèi)翻。由于彈性阻力限制，患兒很難完成足背外展的動(dòng)作[1]。患兒血管生長(zhǎng)異常以及母親懷孕期間的不良生活習(xí)慣如吸煙等均可能與該病的發(fā)生相關(guān)。遺傳與環(huán)境的共同作用導(dǎo)致與足踝部組織攣縮有關(guān)的基因異常表達(dá)，從而造成足踝部組織結(jié)構(gòu)的改變[2,3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）參與調(diào)節(jié)血管生成蛋白的表達(dá)。高表達(dá)的HIF-1可以激活調(diào)節(jié)下游靶基因，使機(jī)體對(duì)缺血、缺氧狀態(tài)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)以使機(jī)體達(dá)到穩(wěn)態(tài)[4,5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1的下游靶因子，參與血管生成的一種重要調(diào)控因子[6]。低氧條件下，VEGF通過(guò)激活下游P38、IKK、EPK等信號(hào)通路，促進(jìn)血管的有絲分裂，增強(qiáng)血管的通透性[7]。此外，學(xué)者發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下，使用Notch通路抑制劑，可觀(guān)察到HIF-1表達(dá)變化，因此猜想該通路可能與先天馬蹄內(nèi)翻足踝部組織攣縮有關(guān)從而導(dǎo)致足部畸形的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物模型建立 10周齡SD大鼠，體重200～350 g，雌鼠20只，雄鼠12只，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2015-0001。分別將5只雌鼠和3只雄鼠合籠，第2 d通過(guò)陰道栓檢查確認(rèn)懷孕。將孕10 d的雌鼠20只隨機(jī)平均分為對(duì)照組（control group，CTL）和實(shí)驗(yàn)組（CTEV），以135 mg/kg全反式維甲酸溶于礦物油對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行灌胃處理，對(duì)照組以相同體積的礦物油灌胃。孕20 d后剖宮取出胎鼠。實(shí)驗(yàn)組孕鼠產(chǎn)出胎鼠75只，其中出現(xiàn)類(lèi)馬蹄內(nèi)翻足癥狀的胎鼠有47只，概率約為62.7%。對(duì)照組獲得胎鼠89只，均未出現(xiàn)畸形。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批（SYYXY2019031001）。

1.1.2 藥物與試劑 HE染色試劑盒，免疫組化試劑盒，Western blot試劑盒，RT-PCR試劑盒，兔抗鼠抗體HIF-1α（ABclonal），VEGF（ABclonal），NOTCH1（ABclonal），ACTB（ABclonal）。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 兩組胎鼠足踝部組織梯度脫水：10%蔗糖30 min，20%蔗糖30 min，30%蔗糖過(guò)夜沉底。修剪組織塊，先用OCT將樣品托覆蓋一層，隨后將組織放在覆蓋好的樣品托上，并將其放于-80℃冰箱預(yù)冷5 min。再次涂上OCT膠水，使組織被膠水完全覆蓋。-80℃冷凍15 min左右，之后進(jìn)行冰凍切片，切片組織厚度為15 mm，加蘇木素染液浸染10 min，去除蘇木素，以流動(dòng)水洗去標(biāo)本表面的浮色。滴加1%鹽酸酒精分化30 s，流水沖洗30 min，使組織呈天藍(lán)色并吸干水。置于伊紅液2 min，洗去伊紅浮液，吸干多余水分，最后進(jìn)行鹽酸酒精梯度脫水，中性樹(shù)脂封片。

1.2.2 RT-RCR檢測(cè)HIF-1，VEGF和Notch1 mRNA的表達(dá) Trizol法提取兩組大鼠足踝部組織總RNA，將混合試劑與反轉(zhuǎn)錄體系相混合，置于冰上得到cDNA模板。選擇適當(dāng)?shù)囊镄蛄腥绫?進(jìn)行擴(kuò)增。并對(duì)引物序列進(jìn)行BLAST分析以確保其準(zhǔn)確性。以Gapdh作為內(nèi)參基因，每份樣品做3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值進(jìn)行計(jì)算。依據(jù)各組的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間相對(duì)基因表達(dá)差異。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequenceof qPCR

1.2.3 免疫組化檢測(cè)兩組HIF-1、VEGF、Notch1蛋白的表達(dá) 兩組大鼠足踝部軟組織冰凍切片方法同前，切片組織厚度15 mm，放入37℃恒溫箱孵育1 h。山羊血清封閉10 min后倒掉，加內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑1滴以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫10 min。PBS沖洗3次每次3 min，除去PBS，加非特異性阻斷劑1滴，室溫孵育10 min。一抗（Hif-1 1：100，VEGF 1：100，Notch 1：100）4℃冰箱過(guò)夜。取出后用PBS洗滌3次每次3 min，置于37℃溫箱40 min，取出后滴加生物素標(biāo)記的與二抗同源的IgG，室溫孵育40 min，PBS洗滌3次每次3 min。除去PBS，加鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶室溫孵育10 min，PBS沖洗3次每次3 min。除去PBS，滴加100 ml新鮮配置的DAB顯色劑（顯色劑按照說(shuō)明書(shū)由試劑A、B、C避光混合配置）。室溫靜置5 min后用流水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，PBS沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明2次2 min，中性樹(shù)脂封片。

1.2.4 免疫印記檢測(cè)兩組HIF-1、VEGF、Notch1蛋白的表達(dá) 取出修剪好的馬蹄內(nèi)翻足踝部組織，按比例加入裂解液研磨，離心取上清，測(cè)蛋白，調(diào)蛋白。加熱8 min，使蛋白變性。參照凝膠配置說(shuō)明書(shū)及目標(biāo)蛋白分子量配制12%的SDS-PAGE凝膠。每組上樣量20 ml，蛋白分子量標(biāo)記物加樣量為10 ml，恒定電壓100 V進(jìn)行電泳，樣品藍(lán)條帶到達(dá)距離玻璃板底面1 cm處或剛好跑出即關(guān)閉電源。在夾板上依次疊放濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙，并夾緊放入轉(zhuǎn)膜槽中。倒入轉(zhuǎn)膜液并放入冰袋100 V轉(zhuǎn)膜1 h，注意黑對(duì)黑，紅對(duì)紅。電泳結(jié)束后，取出PVDF膜放入5%封閉液中封閉2 h。一抗孵育4℃搖床內(nèi)過(guò)夜（HIF-1 1：1000，VEGF 1：1500，Notch 1：1000，β-Actin 1：10000）。二抗孵育1 h，曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析所得數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組足踝部組織結(jié)構(gòu)相對(duì)紊亂，組織間隙增大，存在軟組織松散，部分軟組織聚集攣縮的現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組足踝部組織HE染色Fig.1 HEstaining of ankletissuein each group

2.2 qRT-PCR

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胎鼠足踝部組織HIF-1和Notch1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001），VEGF mRNA表達(dá)水平也低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 兩組HIF-1、VEGF和Notch1的mRNA表達(dá)水平**P＜0.01，***P＜0.001Fig.2 mRNAexpression levelsof HIF-1、VEGFand Notch1 in thetwo groups.**P＜0.01,***P＜0.001

2.3 免疫組化

免疫組化顯色以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)組黃褐色陽(yáng)性顆粒數(shù)目明顯少于對(duì)照組，平均光密度結(jié)果顯示馬蹄內(nèi)翻足大鼠踝部組織中HIF-1、VEGF和Notch1的蛋白表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

圖3 兩組HIF-1、VEGF和Notch1表達(dá)（標(biāo)尺20μm）**P＜0.01，***P＜0.001Fig.3 Theexpression of HIF-1、VEGFand Notch 1 in thetwo groups(Scar bar=20μm).**P＜0.01,***P＜0.001

2.4 Western blot

免疫印跡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠踝部組織HIF-1，VEGF、Notch1含量顯著低于對(duì)照組（圖4）。

圖4 兩組HIF-1、VEGF和Notch1蛋白表達(dá)**P＜0.01，***P＜0.001Fig.4 The protein expression levels of HIF-1、VEGF and Notch 1 in the two groups.**P＜0.01,***P＜0.001

3 討論

先天性馬蹄內(nèi)翻足的病因至今未完全明確，組織血管生成異常被認(rèn)為可能是導(dǎo)致該病的原因。有學(xué)者證實(shí)HIF-VEGF-Notch通路在孕鼠胎盤(pán)中表達(dá)異常；而在足踝部肌肉組織中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)從該角度出發(fā)，探討足踝部組織與HIF-VEGFNotch信號(hào)通路之間的關(guān)系，研究馬蹄內(nèi)翻足畸形發(fā)生的機(jī)制。

HIF-VEGF信號(hào)通路促進(jìn)血管新生。HIF-1是血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，在血管生成中起重要作用。在缺氧條件下，上游的HIF-1α表達(dá)減少，與VEGF啟動(dòng)子中的缺氧反應(yīng)元件特異性結(jié)合可促進(jìn)VEGF的表達(dá)[8]。同時(shí)，由于VEGF可激活Notch信號(hào)通路，VEGF表達(dá)上調(diào)促使Notch信號(hào)通路相關(guān)因子活化，促進(jìn)血管生成[9]。當(dāng)VEGF與VEGFR2受體結(jié)合時(shí)，由于VEGF表達(dá)的增加，引起Notch信號(hào)通路中配體Dll4表達(dá)也隨之增加[10]。Dll4與Notch1結(jié)合，可激活Notch信號(hào)通路下游的靶基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成及分化等[11]。當(dāng)Dll4的表達(dá)受抑制，內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理同樣受到抑制，血管生成明顯降低。以上研究說(shuō)明缺血缺氧時(shí)，機(jī)體通過(guò)激活VEGFNotch信號(hào)通路以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[12]。當(dāng)抑制了VEGF-Dll4通路，血管生成顯著減少，VEGF可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch1及配體Dll4表達(dá)，而Dll4過(guò)度表達(dá)時(shí)，VEGF調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的能力下降，表明VEGF是Dll4的正向調(diào)節(jié)因子，Dll4是VEGF的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠足踝部組織中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HIF-1、VEGF和Notch1含量均下降。缺血缺氧時(shí)HIF-1下降，從而影響VEGF通路的激活，使VEGF的正常表達(dá)受到抑制。研究表明HIF-1α的下降常伴P53基因的上調(diào)，而P53基因可促使細(xì)胞凋亡，阻礙血管修復(fù)，抑制VEGF合成[14]。由于VEGF合成減少，VEGF與VEGFR2受體結(jié)合被抑制，引起Notch信號(hào)通路中配體Dll4表達(dá)下降，Dll4與Notch1/4結(jié)合被抑制，進(jìn)而抑制Notch信號(hào)通路下游的靶基因轉(zhuǎn)錄，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙及分化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-VEGF-Notch信號(hào)通路與馬蹄內(nèi)翻足畸形的發(fā)生存在相關(guān)性。但本實(shí)驗(yàn)存在樣本較少的問(wèn)題，由于致病因素復(fù)雜，本模型由注入維甲酸所得患病胎鼠，與新生患兒患病方式存在差異，實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)論存在一定的局限性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。