桃Pp4CL2基因的克隆及抗寒功能驗(yàn)證

李小蘭，郝蘭蘭，張 帆，王 鴻*

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林果花卉研究所， 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

苯丙烷生物合成途徑是植物主要的次級(jí)代謝途徑，在植物中普遍存在[1]。由苯丙氨酸作為起始底物，經(jīng)苯丙氨酸脫氫酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)以及4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate CoA ligase, 4CL)催化生成4-香豆酸輔酶A后，進(jìn)入不同的分支途徑合成類(lèi)黃酮、木質(zhì)素、色素類(lèi)等不同的多酚類(lèi)次生代謝物。木質(zhì)素作為細(xì)胞壁的重要組成部分，在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中提供機(jī)械支持，其含量與植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的抗性成正比[2-3]。在植物處于逆境時(shí)，應(yīng)激合成的類(lèi)黃酮可以清除植物體內(nèi)由于代謝紊亂超量積累的氧自由基，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。這些重要的次生代謝物是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要途徑之一[5-6]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-8]。

4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)是植物苯丙烷生物合成途徑中的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，處于苯丙烷代謝途徑的終端位置。大多數(shù)植物中4CL基因是以基因家族的形式出現(xiàn)的，如擬南芥中有3個(gè)4CL基因(At4CL1、At4CL2、At4CL3)[9]，大豆(Gm4CL1、Gm4CL2、Gm4CL3、Gm4CL4)[10]和雜種楊中均有4個(gè)4CL基因(Ptd4CL1、Ptd4CL2、Ptd4CL3、Ptd4CL4)[11]。不同家族成員在植物中的作用也不盡相同[12]，4CL基因在植物中的作用主要分為兩類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)參與類(lèi)黃酮的生物合成，第Ⅱ類(lèi)參與木質(zhì)素的生物合成。Cao等[13]通過(guò)對(duì)庫(kù)爾勒香梨4CL基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，只有同時(shí)具有保守結(jié)構(gòu)域LPYSSGTTGLPK和催化活化中心GEICIRG的4CL基因才能夠調(diào)控木質(zhì)素的合成，而不同時(shí)具有這兩種保守結(jié)構(gòu)域的家族基因參與黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成。

目前，關(guān)于4CL基因的研究大多集中在模式作物中，在桃中尚沒(méi)有關(guān)于4CL基因的研究報(bào)道。低溫是影響桃樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布的重要環(huán)境因子。本研究采用RT-PCR方法從‘丁家壩李光桃’中克隆了一個(gè)4CL(Pp4CL2)基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)Pp4CL2的擬南芥和煙草，并對(duì)其抗寒功能進(jìn)行初步分析，以期為桃抗寒新品種的培育提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究材料為抗寒型桃品種‘丁家壩李光桃’，取自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃園。轉(zhuǎn)基因材料使用紅花大莖子煙草(NicotianatabacumL.)組培無(wú)菌苗和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Arabidopsisthalianaecotype Columbia)，均為本實(shí)驗(yàn)室已有材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及Pp4CL2基因克隆稱(chēng)取桃葉片0.1 g，參照植物總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)操作說(shuō)明提取總RNA，以提取的總RNA為模板合成cDNA第一鏈。從課題組前期獲得的‘丁家壩李光桃’抗寒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選Pp4CL2候選基因的轉(zhuǎn)錄本，并通過(guò)NCBI進(jìn)行比對(duì)，獲得Pp4CL2基因全長(zhǎng)CDS序列。使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并回收目的條帶，連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2Pp4CL2生物信息學(xué)分析理化性質(zhì)利用在線網(wǎng)站ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析；采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa＿automat.pl?page=npsa＿sopma.html)對(duì)編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用SMART在線網(wǎng)站(http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位使用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)搜索并下載同源氨基酸序列，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行同源氨基酸序列比對(duì)分析；通過(guò)MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining法建立系統(tǒng)樹(shù)。

1.2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參照曹冬梅等[14]的方法進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。將測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒pMD19-T-Pp4CL2和載體pRI101用KpnⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，在37 ℃的條件下反應(yīng)1～1.5 h后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小并切膠回收。連接目的基因片段與載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。采用凍融法進(jìn)行農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置暗培養(yǎng)48 h左右，挑選單克隆在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌液做PCR鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及鑒定參照郭愛(ài)霞[15]的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化。將煙草組培苗葉片減去主脈及葉柄，剪成0.5 cm×0.5 cm大小的小方塊，浸泡在無(wú)菌水中備用；將葉片夾入已活化好的農(nóng)桿菌箘液中振蕩侵染20 min；取出葉片用無(wú)菌濾紙吸干，葉片正面朝上平鋪于MS培養(yǎng)基上；黑暗預(yù)培養(yǎng)3 d后，將葉片轉(zhuǎn)移到含250 mg/mL頭孢霉素和100 mg/mL卡那霉素的煙草分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為溫度25℃,光照強(qiáng)度6000 Lx，光周期16 h/8 h。當(dāng)芽長(zhǎng)到約1 cm左右時(shí)，剪下繼代到生根培養(yǎng)基，每14 d繼代1次，60 d左右獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)(Tiangen 北京)提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得參照Hu等[16]的方法通過(guò)花序浸染法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。得到T0代擬南芥種子，用75%乙醇處理5 min，2.6%次氯酸鈉處理10 min，去離子水沖洗3次后點(diǎn)播到含卡那霉素的培養(yǎng)基上，用PCR篩選出抗性植株。經(jīng)過(guò)連續(xù)3代的篩選，獲得T3代純合的轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)計(jì)Pp4CL2基因特異引物(表1)，以Actin為內(nèi)參基因[17]，不同時(shí)間低溫處理的cDNA為模板，依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(TaKaRa,大連)說(shuō)明書(shū)，使用Light Cycler?96 Instrument PCR儀(Roche, 瑞士)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBRRPremixExTaqTMⅡ 10 μL，10 μmol/L上/下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。試驗(yàn)結(jié)束后，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,并用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的低溫處理和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定將野生型擬南芥和T3代純合種經(jīng)過(guò)消毒和春化處理，播種到MS培養(yǎng)基上，15 d后將幼苗轉(zhuǎn)移到基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)?；|(zhì)中生長(zhǎng)1個(gè)月以后同野生型煙草和獲得的T1代轉(zhuǎn)基因煙草一同轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱進(jìn)行4 ℃低溫誘導(dǎo)，分別在低溫處理0和12 h時(shí)，選取一組材料采集葉片，立即用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用硫代巴比妥?TBA)反應(yīng)[18]測(cè)定丙二醛含量(MDA)；磺基水楊酸—酸性茚三酮法測(cè)定[19]游離脯氨酸含量(Pro)；考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[20]；蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[21]；使用Yun等描述的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率[22]；過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)含量使用索萊寶POD和SOD試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)采用Excel工作表和SPSS 20.0進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pp4CL2基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以‘丁家壩李光桃’葉片的cDNA為模板，利用特異引物(表1)擴(kuò)增出1 500 bp左右的目的片段(圖1, A)，將純化回收的目的片段連接到pMD19-T克隆載體，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該目的片段與桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的4CL2序列片段完全一致，大小為1 635 bp，為桃的Pp4CL2基因(登錄號(hào)：LOC18792923)。使用ExPASy在線軟件分析Pp4CL2基因的理化性質(zhì)可知：Pp4CL2基因編碼544個(gè)氨基酸殘基；分子式為C2696H4292N708O788S22；相對(duì)分子質(zhì)量為59.94 kD；理論等電點(diǎn)為5.83；正負(fù)電荷數(shù)分別為58、68。不穩(wěn)定系數(shù)為30.32，為穩(wěn)定類(lèi)蛋白；脂肪系數(shù)為99.65；親水性為-0.009，屬于疏水性蛋白。在NCBI網(wǎng)站對(duì)其特定結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有4CL基因家族保守結(jié)構(gòu)域。

表1 引物序列

對(duì)測(cè)序鑒定的含Pp4CL2的pMD19-T-Pp4CL2重組質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pRI101用KpnⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將含有Pp4CL2編碼區(qū)的1 635 bp片段插入表達(dá)載體pRI101，成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pRI101-Pp4CL2(圖1, B)。

圖1 Pp4CL2(A)和pRI101-Pp4CL2(B)的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification results of Pp4CL2(A) and pRI101-Pp4CL2(B)

2.2 Pp4CL2生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件對(duì)Pp4CL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示(圖2)：Pp4CL2蛋白由4種狀態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，其中α螺旋占30.51%、β-折疊占7.35%、不規(guī)則卷曲及延伸鏈分別占41.54%和20.59%。利用New PLACE網(wǎng)站預(yù)測(cè)Pp4CL2前2000 bp序列中的順式作用元件。結(jié)果表明(表2)：該序列含有許多與抗逆性相關(guān)的順式作用元件，如：低溫響應(yīng)元件(LTR)、光響應(yīng)元件(GA-motif)和水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)等。說(shuō)明該基因可以對(duì)外界多種信號(hào)做出響應(yīng)，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和器官形成過(guò)程。

藍(lán)色. α螺旋；紫色. 不規(guī)則卷曲；紅色. 延伸鏈；綠色. β-折疊圖2 Pp4CL2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Blue. Alpha helix； Purple. Random coil；Red. Extended strand； Green. Beta turnFig.2 Secondary structure of Pp4CL2

表2 Pp4CL2順式作用元件分析

通過(guò)NCBI對(duì)Pp4CL2蛋白序列進(jìn)行同源性檢索并通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明(圖3)，Pp4CL2與杏(Prunusarmeniaca)、歐洲甜櫻桃(Prunusavium)和梅(Prunusmume)的相似性最高，分別為99.08%、97.98%和96.14%，與其他物種的4CL2蛋白在C端有較高的保守性，而在N端具有一定的差異，說(shuō)明4CL2基因在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性。為了進(jìn)一步分析Pp4CL2與檢索到的其他物種4CL2的親緣關(guān)系，通過(guò)MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示(圖4)：桃與杏(Prunusarmeniaca，KAH0993361.1)、梅(Prunusmume，XP_008223734.1)和歐洲甜櫻桃(Prunusavium，XP_021810058.1)聚在一個(gè)亞家族，親緣關(guān)系最近，與其他物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 4CL2蛋白多序列比對(duì)Fig.3 Multi-sequence alignment of 4CL2 protein

圖4 Pp4CL2及同源蛋白進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Pp4CL2 and homologous proteins

2.3 轉(zhuǎn)Pp4CL2基因煙草和擬南芥的獲得

將成功構(gòu)建的pRI101-Pp4CL2過(guò)量表達(dá)載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。采用農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉盤(pán)并置于黑暗預(yù)培養(yǎng)3 d，隨后將葉片轉(zhuǎn)移到含頭孢霉素和卡那霉素的煙草分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。葉片分化產(chǎn)生不定芽后，剪下繼代到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d左右時(shí)對(duì)其進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因煙草(圖5)。

A.農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤(pán); B.陽(yáng)性不定芽產(chǎn)生; C.陽(yáng)性不定芽培養(yǎng); D.植株再生;圖5 Pp4CL2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草A. Agrobacterium infect leaf disc of tobacco; B. Generation of positive adventitious buds; C. Culture of positive adventitious buds; D. Plant regenerationFig.5 Genetic transformation of Pp4CL2 gene into tobacco

采用農(nóng)桿菌菌液侵染擬南芥花序，獲得T0代擬南芥種子。對(duì)T0代種子進(jìn)行消毒后點(diǎn)播在含卡那霉素的培養(yǎng)板上，待15 d左右移栽到基質(zhì)中置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定。經(jīng)過(guò)連續(xù)3代的篩選，獲得T3代純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥(圖6)。

A.農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序; B.擬南芥種子點(diǎn)播;C.抗性擬南芥培養(yǎng);D.抗性擬南芥移栽圖6 Pp4CL2基因遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥A. Agrobacterium infect inflorescence of Arabidopsis; B. Arabidopsis seed on-demand; C. Resistance A. thaliana culture; D. Resistance A. thaliana transplantFig.6 Genetic transformation of Pp4CL2 gene into A. thaliana

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的野生型煙草(WT)、擬南芥(WT)，以及轉(zhuǎn)基因煙草(#1、#2、#3)、擬南芥(#1、#2、#3)置于4 ℃培養(yǎng)箱處理0和12 h。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定Pp4CL2基因在不同時(shí)間4 ℃低溫處理下不同株系中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果(圖7)表明：4 ℃處理0和12 h后，擬南芥(圖7, A)和煙草(圖7, B)的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中Pp4CL2基因的表達(dá)量均顯著高于其野生型的表達(dá)量，且處理12 h與處理0 h的表達(dá)量相比，轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量上調(diào)較野生型株系明顯。不同的轉(zhuǎn)基因株系在相同時(shí)間的低溫處理下，Pp4CL2基因的表達(dá)量變化差異不大。

2.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型及生理指標(biāo)測(cè)定

選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的一月生擬南芥幼苗，置于4 ℃培養(yǎng)箱中冷訓(xùn)化24 h后降到-4 ℃處理4 h，觀察表型。結(jié)果(圖8, A)表明：不同株系擬南芥在4 ℃處理4 h之后與處理之前(25 ℃)對(duì)比均出現(xiàn)了不同程度的失水萎蔫現(xiàn)象，野生型株系相較于轉(zhuǎn)基因株系失水萎蔫程度更嚴(yán)重。

圖8 -4 ℃處理下擬南芥(A)和煙草(B)表型Fig.8 Phenotype of A. thaliana (A) and tobacco (B) treated at -4 ℃

將野生型擬南芥株系和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系經(jīng)4 ℃處理0 和12 h后，取葉片測(cè)定其低溫脅迫下的生理生化指標(biāo)。結(jié)果(圖9)表明：4 ℃低溫處理0 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量差異不大。4 ℃低溫處理12 h后，轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著低于野生型株系(圖9, A～B)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥在低溫脅迫下受損傷程度較輕，抗寒能力較強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)經(jīng)4 ℃處理12 h以后，含量顯著高于野生型株系(P<0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)基因能增加植物脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的積累(圖9, C～E)。4 ℃處理下轉(zhuǎn)基因株系的過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性顯著高于野生型株系，說(shuō)明低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的抗氧化能力高，抗寒性強(qiáng)(圖9, F、G)。

圖9 4 ℃低溫脅迫下野生型擬南芥和轉(zhuǎn)Pp4CL2擬南芥的生理生化指標(biāo)Fig.9 Physiological and biochemical indicators of wild and transgenic Arabidopsis thaliana under 4 ℃ low temperature stress

2.6 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的表型及生理指標(biāo)測(cè)定

選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的野生型煙草和過(guò)表達(dá)Pp4CL2基因的煙草組培苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷訓(xùn)化24 h后降到-4 ℃處理2 h，觀察表型(圖8, B)。結(jié)果表明：-4 ℃處理2 h后野生型煙草出現(xiàn)了嚴(yán)重的失水現(xiàn)象，葉片萎蔫卷曲。轉(zhuǎn)基因煙草相比于野生型煙草受害程度較輕，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草對(duì)低溫更具有耐受性。

將野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株系置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 ℃低溫處理，處理0和12 h后進(jìn)行葉片取樣并測(cè)定生理生化指標(biāo)，探究其低溫脅迫下的生理生化變化(圖10)。結(jié)果表明：與野生型株系相比，轉(zhuǎn)基因株系在4 ℃低溫脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量較低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Pp4CL2株系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不易被破壞，抗寒能力強(qiáng)(圖10, A、B)。4 ℃低溫處理0 h時(shí)的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量差異不大，但經(jīng)4 ℃脅迫12 h后轉(zhuǎn)基因煙草的含量顯著高于野生型煙草，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因可以增加植株的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量(圖10, C～E)。轉(zhuǎn)基因煙草在4 ℃低溫脅迫12 h時(shí)，過(guò)氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性顯著高于野生型煙草，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化能力高于野生型煙草(圖10, F、G)。

圖10 4 ℃低溫脅迫下煙草的生理生化指標(biāo)Fig.10 Physiological and biochemical indicators of tobacco under 4 ℃ low temperature stress

3 討 論

近年來(lái)，針對(duì)4CL基因家族的研究已成為熱點(diǎn)。自1987年，Lozoya等[23]首次從歐芹(Petroselinumcrispum)中克隆出2個(gè)4CL基因以來(lái)，水稻(Oryzasativa)[24]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[25]、煙草(Nicotianatabacum)[26]和毛白楊(populustomentosaAcarr)[27]等約40多種植物的4CL基因被相繼克隆出來(lái)，但在桃中尚沒(méi)有關(guān)于4CL基因研究與克隆的報(bào)道。本研究根據(jù)前期獲得的桃響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆得到一個(gè)桃4CL轉(zhuǎn)錄因子家族的4CL2基因，命名為Pp4CL2。序列分析表明：Pp4CL2編碼544個(gè)氨基酸殘基，與其他物種4CL基因的氨基酸序列具有較高的一致性，顯示了Pp4CL2在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。保守基序分析表明：Pp4CL2含有4CL家族保守結(jié)構(gòu)域中的LPYSSGTTGLPK和GEICIRG序列，屬于第Ⅱ類(lèi)4CL基因，參與植物體中木質(zhì)素的生物合成。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：Pp4CL2與杏的4CL基因親緣關(guān)系最近，同源性最高。順式作用元件分析表明：Pp4CL2前2 000 bp序列中含有許多與抗逆性相關(guān)的順式作用元件，說(shuō)明該基因可以響應(yīng)植物體受到的外界刺激，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境應(yīng)答過(guò)程。

前人對(duì)不同物種中4CL基因的克隆及功能驗(yàn)證方面的研究很多，但大都集中在4CL基因?qū)Σ煌锓N生長(zhǎng)發(fā)育方面[28-30]的作用研究，鮮有關(guān)于4CL基因在植物逆境脅迫方面響應(yīng)的研究。前人通過(guò)對(duì)干旱和低溫脅迫下云煙203幼苗[31]和銀杏葉片中[32]的多酚物質(zhì)含量及其代謝相關(guān)酶活性的研究表明，4CL酶活受低溫誘導(dǎo)。但其僅僅關(guān)注低溫脅迫下的酶活，并沒(méi)有對(duì)編碼蛋白的4CL基因進(jìn)行研究和功能驗(yàn)證。低溫是影響桃樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育以及地理分布的關(guān)鍵因素，為了進(jìn)一步研究Pp4CL2在桃低溫響應(yīng)過(guò)程中的功能，我們構(gòu)建了Pp4CL2基因的過(guò)表達(dá)載體，并運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，通過(guò)對(duì)低溫處理下轉(zhuǎn)Pp4CL2基因型和野生型擬南芥和煙草的相對(duì)表達(dá)量、表型和生理生化指標(biāo)的測(cè)定表明，低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草與野生型擬南芥和煙草相比Pp4CL2的相對(duì)表達(dá)量高，受冷害程度輕，具有更高的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，對(duì)低溫具有更強(qiáng)的耐受性。