徐 靈 艾明華 張 慶 彭小春 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部,荊州434000)
食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一,也是癌癥相關(guān)死亡的第六大原因。中國是世界食管癌高發(fā)地區(qū)之一[1]。根治性療法,包括外科手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法或組合療法,對于改善食管癌患者生存結(jié)果非常重要,但食管癌具有高度惡性,晚期食管癌的五年生存率低于25%[2]?,F(xiàn)階段,食管癌進(jìn)展的確切診斷、預(yù)后預(yù)測和潛在機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。許多研究表明,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)在細(xì)胞生物事件的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,包括增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[3-4]。在食管癌等多種人類癌癥中,circRNA 通過競爭性內(nèi)源RNA(com?petitive endogenous RNA,ceRNA)機(jī) 制 發(fā) 揮 微 小RNA(microRNA,miRNA/miR)海綿的作用,從而削弱miRNA對其靶基因的抑制作用[5-6]。circ_0044516是一種在前列腺癌和胃癌中顯著上調(diào)的circRNA,在前列腺癌和胃癌中作為致癌基因發(fā)揮作用[7-8]。除此之外,鮮見關(guān)于circ_0044516 的其他報道。miR-1281 被發(fā)現(xiàn)是急性髓系白血病細(xì)胞中circ_0000370 的潛在靶點之一,此外miR-1281 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[9-10]。但食管癌中miR-1281 與circ_0044516的關(guān)系仍不清楚。因此,本研究考察circ_0044516在食管癌組織中的表達(dá)情況,對circ_0044516 在食管癌Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡中扮演的角色進(jìn)行評價,并結(jié)合其與miR-1281 的關(guān)系探索circ_0044516的作用機(jī)制,為開發(fā)食管癌新型治療靶標(biāo)和生物標(biāo)志物提供新視角。
1.1 資料
1.1.1 臨床資料 新鮮的食管癌組織和相應(yīng)的癌旁組織來自長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院的39 例接受根治性切除術(shù)的患者(其中男24 例,女15 例,年齡50~75 歲,Ⅰ~Ⅱ期20 例,Ⅲ~Ⅳ期19 例)。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療。術(shù)后將所有食管癌和癌旁組織標(biāo)本立即保存在液氮中。本研究經(jīng)長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者在研究前均簽署了知情同意書。
1.1.2 細(xì)胞與試劑 食管癌細(xì)胞株Eca109(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);si-NC、si-circ_0044516模擬物、miR-NC、miR-1281 模擬物、anti-miR-NC、miR-1281抑制物anti-miR-1281(上海GenePharma);細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell count kit-8,CCK-8,日本Dojindo);熒光素酶基因pGL3(上海Invitrogen);Dual-Luciferase Reporter Assay Kit(美國Promega);SYBR Green(美國Applied Biosystems);miRNA RT 試劑盒、miRNA qPCR 試劑盒(上海TIANGEN);活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-caspase)3 兔單克隆抗體、cleaved-caspase9兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體(美國Ab?cam);circ_0044516引物(上海Sangon Biotech)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將含有100 U/ml 鏈霉素/青霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基置于37 ℃飽和濕度下的恒溫培養(yǎng)箱中,該恒溫箱含有5%CO2,在此條件下培養(yǎng)食管癌Eca109 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d,將接種于6孔板的食管癌Eca109細(xì)胞與不含抗生素的培養(yǎng)基一起培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)板的60%~70%時,進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。si-NC組、si-circ_0044516組、miR-NC組、miR-1281組、si-circ_0044516+anti-miR-NC 組 和si-circ_0044516+anti-miR-1281 組按照轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000 說明操作,使用si-NC、sicirc_0044516、miR-NC、miR-1281模擬物、anti-miR-NC、anti-miR-1281 與Lipo2000 混合,轉(zhuǎn)染細(xì)胞。4~6 h后,將混合物移出并用完全培養(yǎng)基替代,48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。
1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)測定circ_0044516和miR-1281表達(dá) 食管癌組織、癌旁組織和食管癌Eca109 細(xì)胞總RNA 使用Trizol 試劑提取,在對RNA樣品進(jìn)行濃縮和純度測定后,將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA 樣品,以U6 和GAPDH 為內(nèi)參。SYBR Green預(yù)混液在實時PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將miRNA RT試劑盒用于miRNA的PCR反應(yīng),將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,按照miRNA qPCR試劑盒中的說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。2-ΔΔCt法對circRNA和miRNA作定量分析。除circ_0044516以外的其他引物序列如下:miR-1281 F:5'-ACACTCCAGCTGGGTCGCCTCCTCC-3',miR-1281 R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGAGAGG-3'[10];U6 F:5'-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3',U6 R:5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3';GAPDH F:5'-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3',GAPDH R:5'-ACTGTGAGGAGGGGA?GATTCAGT-3'。
1.2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞以1×104個/孔 接 種 到96 孔 板 中,轉(zhuǎn) 染 后,食 管 癌Eca109 細(xì)胞培養(yǎng)48 h,并向每個孔中添加10 μl CCK-8 溶液。在37 ℃下孵育90 min,使用全自動酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度OD 值。OD 值與細(xì)胞增殖能力呈正比。
1.2.4 克隆形成實驗測定克隆形成 轉(zhuǎn)染48 h后,收集食管癌Eca109 細(xì)胞,將200 個細(xì)胞接種于6 孔板中,并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 周。將克隆細(xì)胞用PBS 洗滌2 次,在2 ml 甲醇中固定20 min。吸出甲醇后,食管癌Eca109 細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色20 min,用PBS 洗滌3 次,在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。
1.2.5 Western blot 測 定cleaved-caspase3 蛋 白 和cleaved-caspase9 蛋白表達(dá) 食管癌Eca109 細(xì)胞的蛋白在RIPA 裂解液中抽提。制備適當(dāng)濃度的SDSPAGE 凝膠,每個泳道含50~80 μg蛋白。電泳后,采用濕轉(zhuǎn)移法在冰上將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)移膜后用Tris-HCl-Tween20緩沖鹽溶液制備的5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h;加入1:1 000 稀釋的一抗(分別為抗cleaved-caspase3、cleaved-caspase9和GAPDH的抗體),4 ℃過夜,洗滌后加入1:8 000 稀釋的二抗,室溫下孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯影涂布,使用曝光裝置獲得蛋白條帶,通過Image J 軟件評估cleavedcaspase3、cleaved-caspase9表達(dá)。
1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 測定細(xì)胞凋亡時,將食管癌Eca109 細(xì)胞(1×105個)與5 μl Annexin V-FITC 和5 μl 碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色溶液在黑暗中孵育10~20 min,然后采用FACScan流式細(xì)胞儀檢測,在FlowJo 軟件中分析凋亡細(xì)胞占比。
1.2.7 熒光素酶報告實驗分析circ_0044516 與miR-1281 的靶向結(jié)合 使用Circular RNA Interac?tome 靶標(biāo)預(yù)測軟件預(yù)測circ_0044516 與miR-1281的相互作用。為了進(jìn)行熒光素酶報告基因分析,擴(kuò)增含miR-1281 結(jié)合位點的circ_0044516 野生型(WT)、突變型(MUT)片段,并將其克隆到熒光素酶基因pGL3,構(gòu)建WT-circ_0044516、MUT-circ_0044516載體。使用Lipofectamine 2000 將150 ng 野生型載體或突變型載體與2 ng miR-1281 模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染食管癌Eca109 細(xì)胞。48 h 后,使用標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性的Dual-Luciferase Reporter Assay Kit檢測熒光素酶活性。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果表示為±s。兩組間差異通過t檢驗比較,不同組間差異通過單因素方差分析比較,組間兩兩差異通過SNK-q檢測比較,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 circ_0044516 和miR-1281 在食管癌組織中異常表達(dá) 39例食管癌組織中circ_0044516表達(dá)量較相匹配的癌旁組織顯著增加,miR-1281 表達(dá)量較癌旁組織顯著降低(P<0.05),見圖1。
圖1 circ_0044516 和miR-1281 在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expressions of circ_0044516 and miR-1281 in esophageal cancer tissues and adjacent tissues
2.2 干擾circ_0044516 表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖 在食管癌Eca109 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circ_0044516 干擾circ_0044516 表達(dá),si-circ_0044516 組Eca109 細(xì)胞中circ_0044516 表達(dá)量較si-NC 組顯著降低,細(xì)胞增殖能力和平板克隆形成數(shù)也較si-NC組減少(P<0.05),見圖2。
圖2 干擾circ_0044516表達(dá)抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖Fig.2 Interference with expression of circ_0044516 inhibits proliferation of esophageal cancer Eca109 cells
2.3 干擾circ_0044516 表達(dá)促進(jìn)食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡 si-circ_0044516組食管癌Eca109細(xì)胞中凋亡率比si-NC 組升高了約3.09 倍(P<0.05,圖3A),且cleaved-caspase3 蛋白和cleaved-caspase9 蛋白表達(dá)量均高于si-NC組(圖3B)。
圖3 干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with expression of circ_0044516 on apoptosis of esophageal cancer Eca109 cells
2.4 circ_0044516 靶向調(diào)控miR-1281 的表達(dá) cir?cular RNA Interactome 軟件對circ_0044516 與miR-1281 的靶向結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如圖4A 所示。WT-circ_0044516 熒光素酶活性在miR-1281 組中較miR-NC組顯著降低(P<0.05),而MUT-circ_0044516 熒光素酶活性在miR-1281 組、miR-NC 組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4B。pcDNAcirc_0044516 組食管癌Eca109 細(xì)胞中miR-1281 表達(dá)量(0.26±0.02)低于pcDNA 空載體組(1.00±0.00),si-circ_0044516 組食管癌Eca109 細(xì)胞中miR-1281 表達(dá)量(3.27±0.29)高于si-NC 組(1.02±0.07,P<0.05),見圖4C。
圖4 circ_0044516靶向調(diào)控miR-1281的表達(dá)Fig.4 circ_0044516 targets and regulates expression of miR-1281
2.5 miR-1281 過表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡 在食管癌Eca109 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1281模擬物使miR-1281過表達(dá),miR-1281 組miR-1281 表達(dá)量較miR-NC 組增加1.91 倍左右(圖5A),細(xì)胞增殖能力和克隆形成數(shù)較miR-NC 組減少(圖5B、C),而cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達(dá)量和凋亡率較miR-NC 組升高(P<0.05,圖5D、E)。
圖5 miR-1281 過表達(dá)抑制食管癌Eca109 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig.5 Overexpression of miR-1281 inhibits proliferation of esophageal cancer Eca109 cells and promotes cell apoptosis
2.6 下調(diào)miR-1281 表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 在食管癌Eca109 細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)染si-circ_0044516 和an?ti-miR-1281,si-circ_0044516+anti-miR-1281 組miR-1281表達(dá)量、凋亡率、cleaved-caspase3、cleavedcaspase9 蛋白表達(dá)量均低于si-circ_0044516+antimiR-NC 組(圖6A、D、E),細(xì)胞增殖能力和克隆形成數(shù) 高 于si-circ_0044516+anti-miR-NC 組(P<0.05,圖6B、C)。
圖6 下調(diào)miR-1281 表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.6 Down-regulation of miR-1281 expression reversed effect of interference with circ_0044516 expression on proliferation and apoptosis of esophageal cancer Eca109 cells
circRNA 在食管癌在內(nèi)的癌癥中發(fā)揮多種生理上和病理上的作用[10-11]。研究表明,circ_0044516在前列腺癌患者外泌體和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),下調(diào)circ_0044516可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞中miR-29a-3p 的表達(dá)來抑制前列腺癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移[7]。circ_0044516在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),細(xì)胞質(zhì)中circ_0044516 可能作為miR-149-5p 海綿來調(diào)節(jié)HuR 的表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)胃癌異種移植小鼠體內(nèi)腫瘤生長[8]。以上研究表明circ_0044516 在前列腺癌和胃癌中具有致癌作用,但其在食管癌中發(fā)揮的功能與機(jī)制目前尚未可知。本研究通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比,39 例食管癌組織中的circ_0044516 表達(dá)上調(diào),提示circ_0044516 可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究在食管癌Eca109 細(xì)胞中干擾circ_0044516表達(dá),功能實驗證實干擾前列腺癌細(xì)胞中circ_0044516 的表達(dá)會降低前列腺癌細(xì)胞的增殖、提高細(xì)胞凋亡,表明circ_0044516 是食管癌進(jìn)程中一個潛在的癌基因。
研究報道m(xù)iR-1281 在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá),miR-1281 模擬物能減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]。miR-1281 在乳腺癌組織中低表達(dá),干擾其表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成[13]。但miR-1281 是否能調(diào)節(jié)食管癌尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1281在食管癌組織中低表達(dá)。本研究表明,miR-1281的過表達(dá)抑制食管癌Eca109細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。本研究首次揭示了miR-1281 對食管癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響,miR-1281 在食管癌中發(fā)揮抗癌作用,與既往研究相似[13-14]。
據(jù)報道,circRNA 可作為miRNA 海綿參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14-15]。例如,hsa_circ_RNA0023397 與miR-160b 結(jié)合抑制食管癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[16]。hsa_circRNA6448-14作為miR-455-3p的競爭結(jié)合海綿促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[17]。本研究使用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-1281為circ_0044516的潛在靶標(biāo),結(jié)合雙熒光素酶報告基因分析以及qRT-PCR 分析結(jié)果進(jìn)一步證實了這一發(fā)現(xiàn)。在食管癌Eca109 細(xì)胞中下調(diào)miR-1281 表達(dá)則逆轉(zhuǎn)干擾circ_0044516 介導(dǎo)的Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡的作用。綜上,干擾circ_0044516 可促進(jìn)miR-1281 的表達(dá),從而抑制食管癌發(fā)生發(fā)展,表明circ_0044516靶向miR-1281調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的生物功能。
總之,本研究發(fā)現(xiàn)circ_0044516 在食管癌組織中表達(dá)上調(diào),干擾circ_0044516 通過靶向miR-1281促進(jìn)食管癌Eca109 細(xì)胞凋亡和抑制增殖。本研究結(jié)果表明,circ_0044516/miR-1281 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在食管癌中可能是有前途的治療靶點。