基于熒光漂白恢復(fù)技術(shù)檢測乳脂肪球膜上生物分子的流動性

陳 晨，李靖雯，李 丹，韋 偉，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

母乳是人類提供給新生嬰兒最理想的食物，也是嬰幼兒喂養(yǎng)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，其中50%以上的能量是由脂肪供給的[1]。母乳中的脂肪是以大小不同的乳脂肪球的形式存在的，其主要結(jié)構(gòu)是外部生物膜包裹內(nèi)部的甘油三酯核心，外部的生物膜是由極性脂和蛋白質(zhì)等所形成的，具有三層膜結(jié)構(gòu)，通常稱為乳脂肪球膜(Milk fat globule membrane, MFGM)[2]。目前，對乳脂肪球膜微觀結(jié)構(gòu)已有了較為初步的認(rèn)識[3-5]，但是對于乳脂肪球膜上成分的分布情況以及一些特殊結(jié)構(gòu)(如新月區(qū))還未有進一步的認(rèn)識[6]。乳脂肪球膜同其他生物膜一樣具有一定的流動性，整個膜系統(tǒng)中不斷進行著物質(zhì)運輸、新陳代謝與成分更新，這些動態(tài)過程的發(fā)生也是各項生命活動正常進行的必要條件，但目前對乳脂肪球膜特定成分流動性的研究還比較匱乏。

在食品分析檢測領(lǐng)域中，乳狀液的流動性主要是通過物理方法進行測定的，比如通過測定黏度隨剪切速度的變化表征其流變學(xué)的性質(zhì)，也有研究報道通過測定乳脂肪中磷脂脂肪酸組成的差異性來表征乳脂肪球膜的流動性，脂肪酸鏈越短，不飽和程度越高，乳脂肪球膜的流動性越大[7]。但這些測試方法檢測時間長，且并不能夠直觀精準(zhǔn)地表征乳狀液單個分子特定成分的流動性。

本研究通過熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)直接定量測定乳脂肪球膜上不同生物分子的流動性，該方法的原理主要是利用高能激光照射樣本的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆地猝滅，這一區(qū)域稱熒光漂白區(qū)，隨后由于樣本中脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運動，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向熒光漂白區(qū)遷移，使得熒光漂白區(qū)的熒光強度逐漸地恢復(fù)到原有水平[8]。熒光漂白恢復(fù)的參數(shù)值能夠直接比較被標(biāo)記單個分子特定成分(脂質(zhì)和蛋白質(zhì))的流動性差異，可直觀評價其他乳與母乳的接近程度，推動乳制品的精準(zhǔn)評價。同時通過精準(zhǔn)表征天然乳結(jié)構(gòu)特性，優(yōu)選天然乳成分的添加，可全方位模擬天然乳[9]，為配方奶粉的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

乳脂肪球主要由脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物組成的，本實驗利用尼羅紅標(biāo)記乳脂肪球內(nèi)核的甘油三酯，尼羅藍標(biāo)記乳脂肪球膜上的水溶性蛋白，Rh-DOPE標(biāo)記乳脂肪球膜上的磷脂內(nèi)層與外層，Rh-DOPE是一種外源性磷脂熒光探針，其頭部接有熒光團[4]，NBD-PC和NBD-SM分別標(biāo)記分布在磷脂雙層膜外層上的磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(SM)，NBD-PC和NBD-SM分別為PC和SM疏水尾部的脂肪酸鏈上接有熒光基團的外源性染料[10]。利用高分辨率激光共聚焦顯微鏡(CLSM)結(jié)合FRAP技術(shù)觀測各體系的微觀結(jié)構(gòu)，定量分析乳脂肪球的生物分子流動性，該方法直觀地表征天然乳特定成分的流動性，可為乳狀液中膜界面的生化特性研究提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮母乳，本實驗隨機選取一位無錫產(chǎn)婦的成熟乳，該產(chǎn)婦無任何與脂質(zhì)代謝相關(guān)疾?。谎蛉?，由杭州彩洋牧業(yè)有限公司提供；牛乳，由無錫天資乳業(yè)有限公司提供。天然乳樣品儲藏在-18℃下，并在收集 24 h之內(nèi)對其進行物理結(jié)構(gòu)的表征和定量分析。1-palmitoyl-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]dodecanoyl]-sn-glycero-3- phosphocholine(16∶0～12∶0 NBD-PC)、尼羅紅，美國Sigma-Aldrich 公司；N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)di-oleoyl- phosphatidylethanolamine (Rh-DOPE)、N-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino] dodecanoyl]-sphingosine-1-phosphocholine(C12-NBD-SM)，美國Avanti公司；尼羅藍，阿拉丁生化科技有限公司；多聚賴氨酸玻片，南通鎏盛實驗器材有限公司。

ZEISS LSM 880 with Airyscan高分辨率激光共聚焦顯微鏡(CLSM)，德國Zeiss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品染色

取10 μL乳樣，分別與0.1 mg/mL尼羅紅、1 mg/mL Rh-DOPE、0.1 mg/mL尼羅藍、1 mg/mL NBD-PC、0.5 mg/mL NBD-SM按照體積比5∶1、40∶1、50∶1、40∶1、5∶1混合，避光染色 30 min 以上，取 10 μL 樣本放置于多聚賴氨酸玻片上，蓋上蓋玻片，待觀測。

1.2.2 乳脂肪球微觀結(jié)構(gòu)的測定

采用高分辨率激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀測乳脂肪球的微觀結(jié)構(gòu)。CLSM工作參數(shù)設(shè)置：尼羅紅、NBD-SM與NBD-PC熒光探針由Ar+激光器激發(fā)，其中尼羅紅熒光探針激發(fā)波長為514 nm，NBD-SM與NBD-PC熒光探針激發(fā)波長均為488 nm；尼羅藍與Rh-DOPE熒光探針由He-Ne激光器激發(fā)，激發(fā)波長分別為633 nm和543 nm。發(fā)射光接收范圍為405～740 nm，針孔為90.2～156，增益值為700～909，均用40×鏡進行觀測，掃描范圍為512 nm×512 nm。

1.2.3 FRAP檢測乳脂肪球膜上生物分子的流動性

在FRAP實驗中，先按照1.2.1方法對乳脂肪球的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)進行熒光標(biāo)記，通過前期實驗建立的5種熒光探針的FRAP實驗參數(shù)條件(表1)，對乳脂肪球上較小區(qū)域內(nèi)的分子施加不同高強度激光激發(fā)脈沖和不同的漂白次數(shù)，使其不可逆地被光漂白，然后再使用低激光強度成像觀測熒光漂白恢復(fù)情況，CLSM配置的高分辨率檢測器可監(jiān)測乳脂肪球膜周圍區(qū)域中漂白分子與未漂白分子的交換過程。同一平行3組數(shù)據(jù)，優(yōu)選乳脂肪球尺寸基本一致。

表1 不同熒光探針的漂白條件

在FRAP定量分析中，通過CLSM圖獲得熒光漂白恢復(fù)曲線，可計算出單個分子的遷移情況，主要采用以下兩個參數(shù)表征分子的流動性[11-12]：一是熒光恢復(fù)到最后穩(wěn)定值的一半時間的值，即t1/2, 是熒光恢復(fù)后的最大穩(wěn)定值與漂白所達到的最小值之差的一半與最小值的和所對應(yīng)的時間減去最小值所對應(yīng)的時間，它是熒光恢復(fù)速率快慢的一個簡單直接的表征；二是動態(tài)分子比例(Mobile fraction，Mf)，是熒光恢復(fù)后的最大穩(wěn)定值與最小漂白值之間的差與漂白起始值與最小值之間的差之比，其代表了所測乳脂肪球中特定成分的動態(tài)分子比例。

1.2.4 統(tǒng)計分析

本文數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，除部分實驗重復(fù)次數(shù)已作說明以外，其余實驗均重復(fù)測定3次。采用IBM SPSS軟件(20.0 版，IBM，美國)中ANOVA的Ducan檢驗法進行單因素方差分析，P<0.05時具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳脂肪球的微觀結(jié)構(gòu)

圖1為利用尼羅紅標(biāo)記的乳脂肪球中甘油三酯及尼羅藍標(biāo)記的水溶性蛋白質(zhì)的CLSM圖。由圖1可見，3種乳中甘油三酯處于乳脂肪球內(nèi)核的位置，呈實心球狀，熒光探針尼羅紅能夠穿透乳脂肪球膜標(biāo)記球心的甘油三酯，也說明了乳脂肪球膜是一層動態(tài)的生物膜，既可以完成物質(zhì)運輸?shù)葎討B(tài)過程，也可以將乳脂肪球與外界環(huán)境隔開，從而保障內(nèi)部物質(zhì)存在的穩(wěn)定性。而水溶性蛋白質(zhì)環(huán)繞包裹于甘油三酯外圍，母乳脂肪球結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，牛乳中有碎片化的水溶性蛋白質(zhì)的存在，而羊乳脂肪球結(jié)構(gòu)略有破損。

圖1 母乳(A)、牛乳(B)、羊乳(C)乳脂肪球的CLSM圖

圖2為利用Rh-DOPE標(biāo)記的乳脂肪球膜上的極性脂、NBD-SM標(biāo)記的鞘磷脂和NBD-PC標(biāo)記的磷脂酰膽堿的CLSM圖。由圖2可見，Rh-DOPE標(biāo)記的乳脂肪球膜上的極性脂類在乳脂肪球的二維赤道平面外圍呈現(xiàn)環(huán)狀熒光，能夠直觀地證明磷脂呈空心球狀環(huán)繞包裹于甘油三酯外圍，形成了外部的乳脂肪球膜包裹內(nèi)部甘油三酯的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。在不同的極性脂質(zhì)種類中，鞘磷脂是成熟母乳的主要極性脂質(zhì)，NBD-SM標(biāo)記的鞘磷脂在乳脂肪球膜上呈現(xiàn)非均勻分布，有研究者認(rèn)為乳脂肪球膜上具有類似于細(xì)胞膜的鞘磷脂與膽固醇相間形成的具有緊密結(jié)構(gòu)的區(qū)域[10]，維持乳脂肪球結(jié)構(gòu)。母乳中的甘油磷脂的含量僅次于鞘磷脂，主要由PC、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)與磷脂酰乙醇胺(PE)組成，是乳脂肪球膜上主要的不飽和磷脂。NBD-PC 熒光探針在母乳脂肪球上染色呈球狀且乳脂肪球內(nèi)核并未被染色，說明PC主要集中于乳脂肪球膜上，但用NBD-PC標(biāo)記的牛乳和羊乳的內(nèi)核已被染色，可能是因為樣品過冷藏。

從圖2可見，母乳、牛乳和羊乳中Rh-DOPE、NBD-SM、NBD-PC標(biāo)記的乳脂肪球的外圍均出現(xiàn)了放射狀且表面凸起的熒光染色區(qū)域，形狀似月牙，被稱為新月區(qū)(白色箭頭指示)，另外可明顯觀察到凸起狀熒光為附著在乳脂肪球的實體，且此部分實體是依附于乳脂肪球的，它們不對應(yīng)乳脂肪球的部分合并或非球形乳脂肪球，這表明附著實體被磷脂包裹，或?qū)嶓w的組成中富含磷脂[3]。

圖2 母乳(A)、牛乳(B)、羊乳(C)乳脂肪球的CLSM圖

2.2 乳脂肪球膜上生物分子的流動性

前期的實驗結(jié)果表明，漂白區(qū)域的大小決定了熒光恢復(fù)的速度，即相對漂白區(qū)域越大，熒光恢復(fù)所需的時間越長[12]。為更好地說明漂白區(qū)域的一致性，以牛乳為例，在漂白前的CLSM圖中，用圈設(shè)置了3個區(qū)域，分別為用白色箭頭指明的漂白區(qū)域(直徑為30 pixel)、對照區(qū)域(直徑為30 pixel)和背景區(qū)域(直徑為15 pixel)，觀測熒光漂白恢復(fù)過程中這3個區(qū)域的變化情況，結(jié)果如圖3所示。

通過測定圖3中漂白區(qū)域在熒光漂白恢復(fù)過程中的熒光強度，繪制漂白恢復(fù)曲線。母乳、牛乳、羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的漂白恢復(fù)曲線如圖4所示。由圖4可見：漂白前選取了5個測試點(時間點)，熒光強度維持穩(wěn)定；在第6個測試點開始漂白，熒光強度顯著降低，由于不同乳脂肪球膜上的生物分子處于流動狀態(tài), 且生物分子的微觀結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致不同乳脂肪球膜漂白區(qū)內(nèi)的熒光恢復(fù)時間不同。根據(jù)圖4計算3種乳中5種熒光探針標(biāo)記的生物分子的t1/2和Mf，結(jié)果如表2所示。

圖4 母乳、牛乳和羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的漂白恢復(fù)曲線

由表2可見，3種乳的甘油三酯的Mf均在60%～70%之間，且3種乳差異不顯著，牛乳的t1/2為(70.54±14.25)s，流動性相對較慢。牛乳和羊乳的水溶性蛋白質(zhì)的Mf分別為(78.64±6.81)%和(86.91±1.59)%，均顯著高于母乳，可能是由于乳中的蛋白質(zhì)補充至膜結(jié)構(gòu)的漂白區(qū)域，牛乳和羊乳中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已呈現(xiàn)略有不完整的原因，另外3種乳的水溶性蛋白質(zhì)的t1/2差異不顯著。牛乳中Rh-DOPE標(biāo)記的極性脂和NBD-PC標(biāo)記的磷脂酰膽堿的Mf分別為(42.05±4.54)%和(47.12±0.63)%，均顯著高于母乳和羊乳，母乳中極性脂的流動性相對另2種動物乳較慢。這可能是由于母乳中含有的不飽和脂肪酸[7]比羊乳和牛乳低，而磷脂脂肪酸的不飽和程度與脂肪球膜的流動性有很大關(guān)系，脂肪酸的不飽和度越高，乳脂肪球膜的流動性越大。3種乳中鞘磷脂的Mf低，這可能是因為鞘磷脂包裹膽固醇形成的具有緊密結(jié)構(gòu)的區(qū)域是脂筏域[13]，從而對其流動性起到一定程度的束縛作用。

表2 5種熒光探針標(biāo)記的母乳、牛乳和羊乳脂肪球的熒光漂白恢復(fù)特征值

3 結(jié) 論

3種哺乳動物乳(母乳、牛乳、羊乳)乳脂肪球的微觀結(jié)構(gòu)基本一致，均觀察到了新月區(qū)，證實新月區(qū)是磷脂富集區(qū)。FRAP實驗結(jié)果證明乳脂肪球不同生物分子的流動性有差異。乳脂肪球中甘油三酯和水溶性蛋白質(zhì)的動態(tài)分子比例大于極性脂質(zhì)、鞘磷脂和磷脂酰膽堿，母乳中極性脂的流動性相對另2種哺乳動物乳較慢，NBD-PC標(biāo)記的磷脂酰膽堿和NBD-SM標(biāo)記的鞘磷脂在3種乳中流動性差異不顯著。