降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)高氧肺損傷的Notch通路調(diào)控*

鄧 健，王少華

(廣東省深圳市福田區(qū)婦幼保健院兒科 518045)

氧療是臨床常用手段，但當(dāng)早產(chǎn)兒肺組織長(zhǎng)時(shí)間接受高氧時(shí)反而會(huì)引起高氧肺損傷，對(duì)其預(yù)后造成不同程度的影響[1]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP) 為一類主要由感覺(jué)神經(jīng)釋放的生物活性神經(jīng)肽類物質(zhì)[2]。Notch通路是一條參與體內(nèi)多種器官和組織調(diào)控的信號(hào)通路[3]。近年來(lái)，相關(guān)研究表明，CGRP和Notch通路均參與了肺損傷修復(fù)重建過(guò)程[4-5]。然而，對(duì)CGRP是否通過(guò)Notch通路調(diào)控高氧肺損傷的修復(fù)，目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究仍較匱乏。本研究以SD早產(chǎn)鼠及其肺組織作為研究對(duì)象，通過(guò)比較在高氧暴露的不同時(shí)間點(diǎn)使用CGRP及其拮抗劑、Notch信號(hào)通路阻斷劑干預(yù)后肺組織的病理改變，以及其中Notch信號(hào)的Notch l、Hes、heRP mRNA表達(dá)情況，以探討CGRP是否通過(guò)調(diào)控Notch通路對(duì)肺組織發(fā)揮效應(yīng)，從而為高氧肺損傷的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

每天下午將健康SD成年雄鼠和雌鼠(由深圳市拓普生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置)按1∶1比例合籠交配，次日清晨檢查到雌鼠陰道涂片顯示精子者定義為妊娠第0天。雌鼠妊娠第19天用乙醚麻醉后剖宮產(chǎn)取出胎仔作為研究對(duì)象。將胎齡19 d的SD早產(chǎn)鼠分為空氣組(A組)、高氧組(B組)、高氧聯(lián)合CGRP組(C組)、高氧和CGRP聯(lián)合CGRP8-37組(D組)及高氧和CGRP聯(lián)合MW167組(E組)，每組至少18只，依次編為A～E組。CGRP8-37為CGRP拮抗劑，MW167為Notch信號(hào)通路阻斷劑。

1.1.2主要試劑與儀器

主要試劑與儀器為CGRP(ANASPEC)、CGRP8-37 (Wurogentec)、MW167(millipore)、Notch-1 (ABclonal)、heRP(Biobyt)、Hes(Santa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin，HE)染色液(Servicebio)、熒光倒置顯微鏡(Mshot)等。

1.2 方法

1.2.1制備動(dòng)物模型

參照梁木林等[6]介紹的方法制備高氧動(dòng)物模型。同時(shí)對(duì)各組早產(chǎn)鼠腹腔注射干預(yù)試劑，A、B組均為生理鹽水，C～E組分別為CGRP、CGRP聯(lián)合CGRP8-37、CGRP聯(lián)合MW167。注射完畢后約1 h將早產(chǎn)鼠給近期正常分娩的母鼠哺乳。除A組外，B～E組代乳鼠和未成熟鼠均放置在95%高氧容器中，定時(shí)添增水和飼料，持續(xù)14 d 。

1.2.2肺組織標(biāo)本制備及病理檢查

哺乳期第3、7、14 天每組處死6只早產(chǎn)鼠并取出肺組織保存于-80 ℃液氮快速冷凍。常規(guī)切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。采用BAUMAN等[7]介紹的肺組織損傷評(píng)分法評(píng)估其病理改變。

1.2.3定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)法檢測(cè)肺組織 Notch 1、Hes、heRP mRNA表達(dá)水平

提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2．1 肺組織病理改變

A組早產(chǎn)鼠肺組織氣管、血管正常。B、D、E組早產(chǎn)鼠第3天可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第7天可見肺泡上皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫；第14天氣管、血管廣泛破壞，管壁增厚。C組早產(chǎn)鼠第3天大致正常，第7天肺泡間隔少許斷裂，第14天肺泡融合，肺泡內(nèi)充滿滲出液，見圖1。

圖1 各組早產(chǎn)鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理改變比較(HE染色，200×)

2.2 肺損傷病理評(píng)分

C組早產(chǎn)鼠第3、7、14天肺損傷病理評(píng)分均低于B、D、E組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組早產(chǎn)鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺損傷病理評(píng)分比較分)

2．3 肺組織Notch 1、Hes、heRP mRNA表達(dá)水平

C組早產(chǎn)鼠第3、7、14天Notch 1、Hes、heRP mRNA表達(dá)水平均明顯高于B、D、E組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組早產(chǎn)鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織Notch 1、Hes、heRP mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

CGRP由37 個(gè)氨基酸組成，是人類用分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)活性多肽，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，生物半衰期約為18 min[8]。近年來(lái)，有研究表明，人和鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(typealⅡ veolarepithelial cell,AECⅡ)膜上也發(fā)現(xiàn)了CGRP特異性受體及結(jié)合位點(diǎn),并在胚胎肺的發(fā)育和肺生理、病理過(guò)程均發(fā)揮了重要作用[9]。當(dāng)不成熟肺受到氧化應(yīng)激后CGRP通過(guò)免疫調(diào)節(jié)加快清除自由基，減少合成及釋放炎癥因子，并促進(jìn)水通道蛋白過(guò)表達(dá)而減輕肺水腫，從而對(duì)機(jī)體起到抗炎、抗氧化損傷等作用。此外，在氧化應(yīng)激的條件下AECⅡ增殖受到抑制，而CGRP可減弱該抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為AECⅡ，減少功能細(xì)胞凋亡并改善其存活，可能是CGRP促進(jìn)高氧肺損傷修復(fù)的關(guān)鍵[10]。

Notch通路是一條進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路[11]。Notch信號(hào)可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，由此實(shí)現(xiàn)調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)，如分化、增殖、凋亡等[12-13]。因此，Notch信號(hào)通路在肺的發(fā)育、損傷及修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。Notch信號(hào)包括Notch受體、配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子蛋白和調(diào)節(jié)分子等[14]。目前，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的Notch受體有4種(Notch 1～4) ，均廣泛分布于肺組織中。氣道上皮細(xì)胞主要表達(dá)Notch 1、4,肺泡上皮、肺間質(zhì)、血管內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞主要表達(dá)Notch 2、3。Notch 1與配體結(jié)合可啟動(dòng)靶基因Hes、Su(H)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)AECⅡ增殖。在氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞、氣道和肺泡上皮細(xì)胞Notch 1活性下降，表達(dá)減少，AECⅡ轉(zhuǎn)化為AECⅠ，最終影響肺發(fā)育和肺損傷修復(fù)[15]。

本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)鼠在高氧暴露后肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性滲出，間質(zhì)水腫，成纖維細(xì)胞增生，與此同時(shí)，Notch l及其下游靶基因Hes、heRP mRNA表達(dá)均下降。給予外源性CGRP干預(yù)后早產(chǎn)鼠肺組織病理?yè)p傷程度明顯減輕，Notch信號(hào)上升。當(dāng)分別加入CGRP受體拮抗劑——CGRP8-37和Notch信號(hào)通路抑制劑——MW167時(shí)肺損傷程度加重，Notch信號(hào)下降。由此可見，CGRP可能通過(guò)促進(jìn)Notch通路中Notch 1、Hes、heRP等生物信號(hào)的表達(dá)，從而對(duì)氧化應(yīng)激性損傷的肺發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。今后應(yīng)從信號(hào)傳導(dǎo)通路方面闡釋CGRP如何實(shí)現(xiàn)Notch信號(hào)下游靶分子的調(diào)控，可能對(duì)高氧肺損傷的預(yù)防和治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義。