Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒花中α-酸及β-酸超聲提取工藝

段海濤 姚 婷 黃安群 郭誠(chéng)諾 張景峰 李 俊 耿啟泉 張愛(ài)玲

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046；2.北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；4.衛(wèi)輝市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，衛(wèi)輝 453100；5.山東魯莘飼料集團(tuán)有限公司，聊城 252000)

啤酒花(HumuluslupulusL.)，也可稱為酒花、酵母花、蛇麻花等[1]，是傳統(tǒng)的中藥之一，有健胃、安神[2-3]、抗氧化[4]、化痰止咳、抗菌消炎[5-6]等功效。2019年1月25日，歐盟批準(zhǔn)啤酒花抽提物(HumuluslupulusL.flos)作為飼料添加劑用于斷奶仔豬、育肥豬等。

目前，國(guó)內(nèi)外啤酒花提取工藝具有一定的研究進(jìn)展。艾娜絲等[7]對(duì)啤酒花精油超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。Latif等[8]研究了酶解輔助提取啤酒花精油。白璐[9]利用響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取啤酒花α-酸的工藝，提取溶劑為有機(jī)溶劑。目前，啤酒花的有機(jī)溶劑提取研究較多[10-12]，但有機(jī)溶劑的揮發(fā)及后續(xù)處理問(wèn)題較為復(fù)雜，不利于行業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

提取條件如溶劑類型、超聲功率及溫度等均對(duì)提取率產(chǎn)生顯著影響[13-14]，超聲提取中關(guān)于料液比、提取時(shí)間及提取溫度這3個(gè)因素對(duì)α-酸和β-酸提取率的影響研究較少。常規(guī)單因素試驗(yàn)優(yōu)化提取條件不僅耗時(shí)，且需要大量試驗(yàn)，同時(shí)無(wú)法考慮變量之間的交互作用。Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法是一種用于多變量建模和優(yōu)化的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，能夠綜合評(píng)價(jià)一組變量與響應(yīng)值(因變量)的關(guān)系，可用于優(yōu)化提取條件。本試驗(yàn)采用乙醇作為提取溶劑，利用超聲空化作用、熱作用、機(jī)械攪拌、擴(kuò)散、乳化和機(jī)械粉碎等優(yōu)勢(shì)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以提取得到的α-酸和β-酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究超聲提取工藝的最佳條件，為啤酒花提取加工企業(yè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

顆粒狀啤酒花樣品由新疆某啤酒花有限公司提供。

1.2 主要試劑

甲醇(分析純，天津康科德科技有限公司)、乙醇(分析純、濰坊銘陽(yáng)實(shí)驗(yàn)分析儀器有限公司)、氫氧化鈉飽和溶液、蒸餾水等。

1.3 主要儀器

Multiskan Go分光光度計(jì)(金業(yè)德祥生物科技有限公司)、METVX200-T振蕩器(施銳貿(mào)易有限公司)、FRQ-1004T超聲波清洗機(jī)(蘇州力翰威自動(dòng)化設(shè)備有限公司)、ZN-02型粉碎機(jī)(興時(shí)立和科技發(fā)展有限公司)等。

1.4 α-酸和β-酸含量檢測(cè)方法

啤酒花中的活性成分主要為α-酸(葎草酮類)和β-酸(蛇麻酮類)，其中α-酸主要為葎草酮、合葎草酮和加葎草酮，β-酸主要為蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮[5]。

啤酒花α-酸、β-酸含量的檢測(cè)方法參照GB/T 20639—2006。準(zhǔn)確稱取混合均勻的啤酒花樣品1.000 0 g，放入燒杯中，加入20.0 mL乙醇，放入超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲提取，精確移取0.5 mL上清液放入10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，此為A液。再移取A液0.6 mL放入10 mL的容量瓶中，用堿性甲醇(100 mL的甲醇中加入6 mol/L的NaOH 0.2 mL)定容，此為B液。分別在波長(zhǎng)275、325及355 nm下測(cè)定B液的吸光度值，α-酸和β-酸含量的計(jì)算公式為：

α-酸含量(%)=0.666 7×[-(51.56×A355)+(73.79×A325)-(19.07×A275)];β-酸含量(%)=0.666 7×[-(55.57×A355)-(47.59×A325)+(5.10×A275)]。

式中：A355、A325、A275分別為B液在波長(zhǎng)355、325、275 nm下的吸光度值，其余數(shù)據(jù)均為公式中的經(jīng)驗(yàn)值。

1.5 試驗(yàn)單因素設(shè)定范圍

本試驗(yàn)以乙醇為溶劑，超聲清洗機(jī)頻率為49 Hz，經(jīng)前期摸索，料液比分別設(shè)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g∶mL)；提取溫度分別設(shè)為20、30、40、50、60 ℃；提取時(shí)間分別設(shè)為10、20、30、40、50 min。單因素試驗(yàn)每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)4次。

1.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert軟件，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素為自變量，提取液中α-酸和β-酸含量為響應(yīng)值，按照3因素3水平進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，確定啤酒花超聲提取的最佳工藝條件。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均值差異顯著性檢驗(yàn)，顯著標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。采用Design-Expert 10.0.4對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立以α-酸和β-酸含量為響應(yīng)值的復(fù)合評(píng)價(jià)體系，設(shè)計(jì)3因素3水平的二次回歸方程，擬合自變量與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系。將得到的2個(gè)回歸方程聯(lián)立共解，以獲得同時(shí)滿足α-酸、β-酸提取的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同料液比對(duì)α-酸和β-酸含量的影響見(jiàn)圖1。提取液中α-酸和β-酸含量隨料液比的增加呈先升高后降低趨勢(shì)。料液比為1∶25時(shí)α-酸和β-酸含量顯著高于料液比為1∶10、1∶15及1∶30時(shí)(P<0.05)，與料液比為1∶20時(shí)差異不顯著(P>0.05)。根據(jù)上述結(jié)果，選擇料液比1∶25作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Data points with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below.圖1 料液比對(duì)α-酸和β-酸含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on α-acid and β-acid contents

2.1.2 提取溫度對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同提取溫度對(duì)α-酸和β-酸含量的影響見(jiàn)圖2。提取液中α-酸和β-酸含量隨提取溫度的升高先升高后降低。提取溫度為20 ℃時(shí)α-酸含量顯著低于其余4個(gè)提取溫度(P<0.05)；提取溫度為40 ℃時(shí)β-酸含量顯著高于20 ℃時(shí)(P<0.05)。根據(jù)上述結(jié)果可知，α-酸和β-酸的提取率隨提取溫度的升高呈先升高后降低趨勢(shì)，30～60 ℃時(shí)雖差異不顯著(P>0.05)，但以40 ℃為中點(diǎn)，因此選擇提取溫度40 ℃作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

圖2 提取溫度對(duì)α-酸和β-酸含量的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on α-acid and β-acid contents

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同提取時(shí)間對(duì)α-酸和β-酸含量的影響見(jiàn)圖3。提取液中α-酸和β-酸含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。提取時(shí)間為40 min時(shí)α-酸含量顯著高于提取時(shí)間為10和20 min時(shí)(P<0.05)，與提取時(shí)間為30、50 min時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)；提取時(shí)間為40 min時(shí)β-酸含量顯著高于提取時(shí)間為10 min時(shí)(P<0.05)，與其余提取時(shí)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。α-酸和β-酸的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)，30～50 min時(shí)雖差異不顯著，但以40 min為中點(diǎn)，因此選擇提取時(shí)間40 min作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平，詳見(jiàn)表1。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface test

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of response surface test

利用Design Expert10.0.4軟件進(jìn)行回歸模型方差分析和顯著性檢驗(yàn)，分別得到α-酸(Y1)和β-酸含量(Y2)與3個(gè)因素料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)的三元二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y1=54.46-10.97×A+5.77×B+6.62×C-0.51×AB-8.44×AC+2.83×BC-16.47×A2-20.44×B2-10.61×C2；Y2=48.74-7.68×A+3.59×B+3.56×C-0.72×AB-4.59×AC+1.12×BC-14.59×A2-16.78×B2-11.93×C2。

由表3和表4可以看出，2個(gè)回歸模型都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，決定系數(shù)(R2)分別為0.945 9和0.964 2，同時(shí)失擬檢驗(yàn)不顯著(P>0.05)，說(shuō)明模型與實(shí)際結(jié)果擬合良好。

表3 α-酸含量作為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model with α-acid content as response value

表4 β-酸含量作為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for regression model with β-acid content as response value

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)中各個(gè)因素的交互作用分析

利用Design Expert 10.0.4軟件，根據(jù)得到的回歸方程，對(duì)表3和表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，繪制不同的影響因素對(duì)響應(yīng)值的三維曲線圖，響應(yīng)面的陡峭程度表明各個(gè)自變量對(duì)于α-酸和β-酸含量的影響情況。等高線的密集程度可表示因素的變化對(duì)α-酸和β-酸含量的影響程度[15-16]。

由圖4及表3可知，在等高線的中心區(qū)域，α-酸含量最高，由中心向邊緣逐漸降低。在3個(gè)因素中，料液比對(duì)α-酸含量的影響極顯著(P<0.01)，提取時(shí)間對(duì)α-酸含量的影響顯著(P<0.05)，提取溫度對(duì)α-酸含量的影響顯著(P<0.05)，料液比和溫度的交互作用對(duì)α-酸含量的影響顯著(P<0.05)。等高線密集程度及響應(yīng)面的陡峭程度表明，料液比對(duì)α-酸含量的影響最大，其次是提取溫度及提取時(shí)間。

圖4 各因素對(duì)α-酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graphs for effects of various factors on α-acid content

由圖5及表4可知，在等高線的中心區(qū)域，β-酸含量最高，由中心向邊緣逐漸降低。3個(gè)因素中，料液比對(duì)β-酸含量的影響極顯著(P<0.01)，提取時(shí)間及提取溫度對(duì)β-酸含量的影響呈弱顯著性(P=0.058 2、P=0.059 8)，提取溫度和提取時(shí)間的交互作用顯著影響β-酸含量(P<0.05)。等高線密集程度及響應(yīng)面的陡峭程度表明，對(duì)β-酸含量影響最大的是料液比，其次是提取時(shí)間及提取溫度。

圖5 各因素對(duì)β-酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graphs for effects of various factors on β-acid content

將2個(gè)回歸方程聯(lián)立求解，對(duì)各自變量求導(dǎo)，得到α-酸和β-酸的最佳提取條件：即料液比1∶10，提取時(shí)間50 min，提取溫度54 ℃，此時(shí)回歸模型預(yù)測(cè)α-酸含量為51.16%，β-酸含量為43.16%。

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，用試驗(yàn)得到的最佳提取條件對(duì)啤酒花中的α-酸和β-酸進(jìn)行超聲提取，共重復(fù)3次作為平行試驗(yàn)，測(cè)定α-酸和β-酸含量，取平均值，最終得到的實(shí)測(cè)結(jié)果α-酸含量為50.89%，β-酸含量為42.93%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，吻合良好，模型準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測(cè)啤酒花實(shí)際提取中α-酸和β-酸的提取情況。

3 討 論

3.1 料液比對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

料液比是直接影響物質(zhì)與溶劑間擴(kuò)散效率的重要因素之一，在料液比較小或處于某一范圍內(nèi)時(shí)，提取率隨料液比的增大而增大，溶劑析出效應(yīng)占主導(dǎo)[17]，但當(dāng)物質(zhì)與溶劑間的擴(kuò)散達(dá)到了平衡狀態(tài)時(shí)，料液比增大將會(huì)出現(xiàn)提取率下降趨勢(shì)[15,18]。連文綺[14]研究微波提取啤酒花中α-酸和β-酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，料液比過(guò)小，萃取不完全，料液比過(guò)大，造成萃取溶劑浪費(fèi)及后期加工費(fèi)用提升等問(wèn)題。此外，料液比與溶液黏稠度相關(guān)，料液比較低時(shí)，溶液黏稠，有效成分溶解不夠充分，不利于超聲提取，當(dāng)料液比增加時(shí)，多糖分子易于溶出，提取率增大[19]。在本試驗(yàn)中，改變料液比，α-酸和β-酸含量隨料液比增加而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在料液比由1∶10增加至1∶25時(shí)，α-酸和β-酸含量逐漸上升，原因可能是料液比較小時(shí)，溶液的黏度較大，分子擴(kuò)散速度低，提取率小，隨著料液比的繼續(xù)增加，溶液中α-酸和β-酸的含量降低，使更多的α-酸和β-酸從啤酒花中釋放出來(lái)，提高提取率。當(dāng)料液比進(jìn)一步提升時(shí)，α-酸和β-酸從啤酒花中釋放出來(lái)的增加量小于溶劑添加量，溶質(zhì)被進(jìn)一步稀釋，因此α-酸和β-酸的含量又呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

3.2 提取溫度對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

溫度升高能夠加快分子運(yùn)動(dòng)速度和分子滲透擴(kuò)散能力，加快物質(zhì)溶出率，提高提取率[20]。冷進(jìn)松等[21]研究啤酒花精油超聲輔助水酶法提取工藝，研究發(fā)現(xiàn)最適提取溫度為50 ℃。王亞南[22]提取啤酒花中總黃酮，最適提取溫度為52 ℃，超聲負(fù)壓連續(xù)提取有效減少提取過(guò)程中活性成分損失。在本試驗(yàn)中，α-酸和β-酸含量隨提取溫度的升高而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，提取溫度升高，啤酒花內(nèi)部的分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，更有利于α-酸和β-酸的析出，提取液中α-酸和β-酸的含量升高，提取率增加，但是提取溫度繼續(xù)升高，超過(guò)40 ℃后會(huì)對(duì)啤酒花分子造成一定程度的破壞，從而導(dǎo)致提取率降低。夏娜[23]研究發(fā)現(xiàn)，溫度越高，啤酒花中α-酸和β-酸提取率變化幅度變大，損失率升高，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

3.3 提取時(shí)間對(duì)超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

超聲具有空化作用、熱作用、機(jī)械攪拌、擴(kuò)散、乳化和機(jī)械粉碎等優(yōu)勢(shì)，一定范圍內(nèi)，延長(zhǎng)提取時(shí)間可提升提取率[24-25]。孫世琨[26]探究啤酒花中黃酮類物質(zhì)的提取，發(fā)現(xiàn)超聲最佳提取條件為：乙醇溶液濃度60%，提取時(shí)間15 min，料液比1∶30(g∶mL)。在本試驗(yàn)中，提取液中α-酸和β-酸含量均隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，但到40 min后α-酸和β-酸含量會(huì)逐漸變得平穩(wěn)，無(wú)明顯下降，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)其提取率的改變已無(wú)明顯作用。與前人研究結(jié)果不同的原因在于，本試驗(yàn)采用超聲提取，以乙醇作為提取溶劑，從提取率來(lái)看，本試驗(yàn)采用超聲提取的提取率優(yōu)于微波提取[23,26]。

3.4 本試驗(yàn)α-酸和β-酸提取率與前人結(jié)果對(duì)比分析

提取方式不同，啤酒花中α-酸和β-酸的提取率有所差異。艾娜絲等[7]探究超臨界CO2萃取“青島大花”啤酒花精油的最適工藝參數(shù)，以干制啤酒花為原料，以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間為試驗(yàn)因子，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳工藝參數(shù)，啤酒花精油的得油率為5.3%，主要成分為月桂烯(40.37%)、α-律草烯(9.12%)、反式石竹烯(4.67%)。白璐[9]采用響應(yīng)面法建立乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間3個(gè)因素與α-酸含量之間的數(shù)學(xué)模型，確定啤酒花的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度70.74%，料液比1∶20.93，微波時(shí)間79.62 s。在此條件下，α-酸含量可達(dá)14.02%。連文綺[14]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助萃取α-酸、β-酸的最佳工藝參數(shù)，最佳條件下α-酸含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為43.65%，β-酸含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為35.03%。本試驗(yàn)采用超聲提取，最佳提取條件下，α-酸含量為50.89%，β-酸含量為42.93%。與前人研究結(jié)果不同的原因在于，超聲提取與微波提取方式不同，但α-酸含量均呈現(xiàn)高于β-酸含量的趨勢(shì)。

4 結(jié) 論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取條件后可有效提高啤酒花中α-酸和β-酸的提取率，與本文中單因素試驗(yàn)結(jié)果相比，α-酸提取率提高約20%，β-酸提取率提高約16%。優(yōu)化后啤酒花中α-酸和β-酸的最佳提取條件為：料液比1∶10、提取溫度54 ℃、提取時(shí)間50 min。