17 年陳案被害人衣物檢出DNA 基因型1 例

高金林，喬偉，徐慶

泰州市公安局刑事警察支隊(duì)，江蘇 泰州 225300

1 案 例

1.1 簡要案情

張某，女，某年3 月12 日下午失蹤，當(dāng)年4 月4 日，當(dāng)?shù)匾淮迕裨谧约曳胖秒s物的豬圈中發(fā)現(xiàn)死者尸體。死者衣著整齊，面朝墻躺于豬圈內(nèi)側(cè)。由于當(dāng)時(shí)偵破條件有限，本案一直未能獲得有效的破案線索，也未獲得嫌疑人的DNA 分型。17 年后，應(yīng)公安部“云劍2020”行動的要求，對張某被殺案現(xiàn)場檢材進(jìn)行再次檢驗(yàn)。

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 檢材前處理

送檢檢材為1 件尼龍外套、1 條帆布牛仔褲、1 個黑色皮質(zhì)雙肩包。鑒于檢材情況和案件檢驗(yàn)要求，將3 個檢材都分成若干區(qū)域，檢材的粗糙面用粘取器粘取、光滑面用棉簽擦拭的方式采集樣本。外套上提取73 份檢材、牛仔褲上提取79 份檢材、雙肩包上提取106 份檢材，合計(jì)258 份。

1.2.2 檢材DNA 提取

上述樣本均使用微量檢材DNA 提取試劑盒（煙臺澳斯邦生物工程有限公司）提取，過夜孵育后，在LET-8-PURE DNA 提取工作站（煙臺澳斯邦生物工程有限公司）上進(jìn)行DNA 提取純化。具體步驟如下：（1）裂解。將檢材放入套管，套管放入2.0 mL 微量離心管中，加入500 μL 裂解液、15 μL 蛋白酶K，混合均勻；56 ℃振蕩保溫處理混合液，8 h 以上過夜孵育。之后套管放入PicoTM17 微量離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），10 000×g離心3 min；去掉載體和套管，此時(shí)消化液全部在2.0 mL 微量離心管內(nèi)。（2）將離心管和相應(yīng)提取、洗滌、洗脫試劑按照LET-8-PURE DNA 提取工作站要求放置到工作站指定位置，運(yùn)行工作站。（3）工作站將納米磁珠、結(jié)合液、消化液進(jìn)行充分混合，按照結(jié)合、洗滌、洗脫的步驟自動提取，最終得到提取液。提取液作為模板，進(jìn)行STR擴(kuò)增。

1.2.3 STR 分型

使用VeriFilerTMPlus STR 擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）對258份檢材中的23個常染色體STR 和2 個性別標(biāo)記Amelogenin和Y-InDel進(jìn)行檢測。根據(jù)常染色體STR檢驗(yàn)結(jié)果，在樣本質(zhì)量較高的男性DNA 樣本中使用6 色熒光檢測體系YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行Y-STR 檢測，擴(kuò)增體系為10 μL，均按照試劑盒說明書推薦流程操作。擴(kuò)增反應(yīng)在9700 型PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在3500 型基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，并利用GeneMapperID-Xv1.4 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行分型判讀。

1.3 檢測結(jié)果

1.3.1 常染色體STR 檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢驗(yàn)，在外套衣領(lǐng)、外套正面左側(cè)、牛仔褲右褲腿正面、牛仔褲左褲腿反面、牛仔褲正面左口袋、雙肩包左包帶正面、黑色皮質(zhì)雙肩包背帶上的皮扣等29份檢材中檢測出常染色體STR 有效分型（表1）。其余檢材中，部分提取物獲得混合常染色體STR 分型結(jié)果，部分提取物未獲得常染色體STR 分型結(jié)果。

表1 29 份檢材VeriFilerTM Plus 擴(kuò)增試劑盒分型結(jié)果Tab.1 Genotypes generated from VeriFilerTM Plus PCR amplification kit of 29 samples

1.3.2 Y 染色體STR 檢驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒對258 份檢材中經(jīng)常染色體STR 檢驗(yàn)后疑似含有Y 染色體的檢材進(jìn)行Y-STR 檢測，包括尼龍外套、帆布牛仔褲、黑色皮質(zhì)雙肩包等共32 份檢材提取液。Y-STR 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在牛仔褲左褲腿反面2 份檢材獲得了同樣的有效分型（表2），28 份獲得混合Y-STR 分型，2 份未獲得Y-STR 分型。

表2 牛仔褲檢材YFilerTM Plus PCR 擴(kuò)增試劑盒分型結(jié)果Tab.2 Genotypes generated from YFilerTM Plus PCR amplification kit of samples on jeans

雙肩包左包帶正面檢出1 名男性個體的13 個常染色體STR 分型結(jié)果。外套正面左側(cè)、牛仔褲左褲腿反面、牛仔褲正面左口袋上均檢出2 名個體的常染色體STR 混合分型結(jié)果，結(jié)合女性常染色體STR 分型結(jié)果進(jìn)行拆分，綜合考慮色譜峰的峰高與數(shù)目等情況，得到1 名男性個體的VeriFilerTMPlus 試劑盒23 個常染色體STR 分型結(jié)果，并與黑色皮質(zhì)雙肩包左包帶正面檢出基因座上的分型結(jié)果一致。在牛仔褲左褲腿反面2 份檢材中檢出同一名男性個體的Y-STR 分型結(jié)果。將黑色皮質(zhì)雙肩包左包帶正面的常染色體STR 結(jié)果入庫比對，比中多地DNA 數(shù)據(jù)庫中的同一嫌疑人徐某。經(jīng)審查，嫌疑人對其搶劫、強(qiáng)奸（未遂）殺害受害人的犯罪事實(shí)供認(rèn)不諱。

2 討論

隨著DNA 檢驗(yàn)技術(shù)靈敏度的提高，接觸性生物檢材中DNA 分型被成功解析的可能性逐漸增加，其在案件中發(fā)揮的作用也越來越大。此次在17 年前的受害人衣物上檢出嫌疑人的Y-STR 單一分型結(jié)果和可拆分的2 名個體的常染色體STR 混合分型，彰顯了DNA 檢驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展。此次檢驗(yàn)中檢材取樣位點(diǎn)多，工作量大，自動化DNA 提取設(shè)備及其配套提取試劑的應(yīng)用為檢驗(yàn)工作提供了便利，最終在受害人的衣物上成功檢出嫌疑人的STR 分型。

本案使用LET-8-PURE DNA 提取工作站和微量檢材DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，其中微量檢材DNA 提取試劑盒中包含懸浮性好且捕獲率高的納米磁珠和微量DNA 回收效率高且去抑制能力強(qiáng)的配套試劑，是陳舊性微量檢材DNA 提取的關(guān)鍵。本案中，由于檢材陳舊且量微，在裂解過程中適當(dāng)延長時(shí)間，并適當(dāng)增加微量檢材DNA 提取試劑盒中的結(jié)合緩沖液促進(jìn)DNA 和磁珠結(jié)合，純化過程采用原位移除廢液的方式減少磁珠損失，最終從陳舊的微量檢材中獲取到足夠的DNA 模板?？傮w來講，檢驗(yàn)靈敏度的提高對案件檢驗(yàn)至關(guān)重要，但也對實(shí)驗(yàn)室的防污染提出了更高的要求。為了盡最大可能避免外源性DNA 污染，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)條件應(yīng)建立3 條檢測線，即人員樣本檢測線、常量檢材檢測線、微量檢材檢測線，同時(shí)，各檢測線之間的儀器盡量不通用且實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部空間必須設(shè)置緩沖區(qū)。

衣物類檢材由于接觸人體皮膚，長期摩擦?xí)z留人體脫落的上皮細(xì)胞，如衣領(lǐng)、拉鏈、袖口、腋下等部位為有可能留下生物檢材的常見部位[1]，這為進(jìn)行DNA 檢測提供了可能。然而，衣物類檢材屬于接觸類檢材，所含DNA 屬于低拷貝模板，實(shí)踐中也存在多人穿同一件衣服或者衣服與他人皮膚摩擦的可能，所以衣物檢材檢出混合DNA 也較為常見。綜合來看，該類檢材存在以下特點(diǎn)：（1）數(shù)量較少的脫落表皮細(xì)胞幾乎散在分布于較大面積的載體上，這給實(shí)際搜集脫落細(xì)胞帶來困難[2]；（2）當(dāng)載體表面較為粗糙、結(jié)構(gòu)較為松散時(shí)，其與脫落細(xì)胞和污物結(jié)合緊密，此時(shí)脫落細(xì)胞可能難以洗脫[3]；（3）脫落細(xì)胞多為角化的上皮細(xì)胞，由于保存時(shí)間較長或者其所處的環(huán)境中包含各種洗滌劑、灰塵、細(xì)菌等不利條件的影響，后續(xù)提取到的DNA 量微或已降解[4]，這將增大DNA 的提取與富集難度。此外，如果衣物類檢材長期暴露于空氣中，可能會留有大量污物，這些污染物將隨著DNA 一同被消化提取[5]，污物中的某些金屬離子及多種洗滌劑成分可抑制PCR 反應(yīng)，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗[6]。綜上所述，采用有效的方法搜集到足夠量的脫落細(xì)胞，并去除PCR 擴(kuò)增過程中的多種抑制性因素的影響是DNA檢驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

本次檢驗(yàn)結(jié)果表明，現(xiàn)有技術(shù)已極大地提高了DNA 檢測的靈敏度，但這對檢材的保存也提出了更高的要求。對于未破案件的現(xiàn)場檢材應(yīng)陰干后保存，切忌把潮濕的檢材直接保存。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)檢材狀態(tài)的不同，采取不同的樣本采集方式。如光滑表面的載體，可采取棉簽兩步法擦拭或者負(fù)壓吸取；粗糙面的載體，可采取負(fù)壓吸取、粘取、剪取等方式提取。檢材前處理時(shí)提取檢材的面積，不用太大也不宜太小，在第一次檢驗(yàn)后，根據(jù)初檢情況，可針對重要部位進(jìn)行二次檢驗(yàn)。在進(jìn)行常染色體檢驗(yàn)的同時(shí)，如果包含男性被檢者，可結(jié)合Y 染色體檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合受害人圖譜和疑似包含嫌疑人結(jié)果的混合圖譜，通過整體圖譜和單個基因座分型結(jié)果進(jìn)行人工分析，在混合圖譜中拆分出疑似嫌疑人STR 分型，最終獲得確鑿的嫌疑人常染色體和Y 染色體結(jié)果，為案件提供證據(jù)或者破案線索。