miR-326的功能及其在自身免疫病中作用的研究進(jìn)展①

徐 璐 王麗華 盧曉宇 王健健 張薈雪 （哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150081）

免疫系統(tǒng)是一種可防止病原體侵害機(jī)體的復(fù)雜機(jī)制，其通過巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的吞噬作用清除體內(nèi)變形、衰老的細(xì)胞及免疫復(fù)合物等，同時(shí)對(duì)自身成分保持耐受。然而，當(dāng)免疫開始向病原性自身免疫發(fā)展時(shí)，機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)將被打破，最終導(dǎo)致自身免疫病（autoimmune disease，AD）［1］。近年來，國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)各類微小RNA（microRNA，miRNA）介導(dǎo)多種AD 甚至腫瘤等病理過程，其中，miR-326 在AD 中的作用已引起廣泛關(guān)注。DU 等［2］在對(duì)多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）患者和自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encepha‐lomyelitis，EAE）動(dòng)物模型的研究中均發(fā)現(xiàn)miR-326表達(dá)明顯升高；SEBASTIANI 等［3］研究證實(shí)1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）患者外周血中miR-326 表達(dá)顯著增高；此外，SUN 等［4］在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、ZHAO等［5］和LIU 等［6］在自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）中也報(bào)道了類似的發(fā)現(xiàn)。而LIU等［7］在針對(duì)免疫性血小板減少癥（immune thrombocyto‐penia，ITP）患者的研究中則發(fā)現(xiàn)miR-326 表達(dá)明顯下調(diào)，以上研究均表明miR-326在AD中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本文從miR-326 的功能及作用機(jī)制入手，對(duì)miR-326 在AD 中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為AD的研究提供新思路。

1 miRNA的表達(dá)與功能

全基因組轉(zhuǎn)錄組譜分析揭示了人類基因組中存在miRNA，miRNA 是一類由18~25 個(gè)核苷酸組成的單鏈小分子非編碼RNA，其廣泛存在于基因調(diào)控、表觀遺傳基因調(diào)控和蛋白質(zhì)功能調(diào)控的各個(gè)階段［8］。據(jù)估計(jì)，人類基因組中大約有1 500個(gè)miRNAs，這些miRNAs 潛在調(diào)節(jié)20%~30%的人類基因［9］。miRNA 的生物發(fā)生包括一系列成熟步驟：miRNA 首先通過RNA 聚合酶Ⅱ在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄為初級(jí)mi-RNA（pri-miRNA），pri-miRNA 被酶-蛋白質(zhì)微處理器復(fù)合物識(shí)別并切割為70~100 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的前體miRNA（pre-miRNA），這些pre-miRNA 被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，Dicer（RNA 聚合酶Ⅲ家族成員）與其5'及3'末端相互作用，進(jìn)一步切割以產(chǎn)生20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的miRNA/miRNA 雙鏈體，此雙鏈體被Argonaute 蛋白（AGO）整合到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-in‐duced silencing complex，RISC）上，后者提供了引導(dǎo)miRNA 鏈錨定至靶標(biāo)mRNA 的作用，在此過程中，與引導(dǎo)鏈互補(bǔ)的miRNA 鏈降解并允許引導(dǎo)鏈mi-RNA 與靶mRNA 的3'端非編碼區(qū)（untranslated re‐gions，UTR）相互作用以調(diào)節(jié)其表達(dá)［10］。一旦引導(dǎo)鏈miRNA 和靶基因mRNA 間的互補(bǔ)堿基匹配并穩(wěn)定，RISC 復(fù)合體的AGO 蛋白就會(huì)誘導(dǎo)靶mRNA 的內(nèi)切核酸裂解，從而導(dǎo)致mRNA 降解，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)作用［11］。miRNA 不僅可與靶基因mRNA 的3'UTR 互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯沉默，也可與靶基因的5'UTR、啟動(dòng)子或編碼區(qū)結(jié)合［12］。

隨著基因組學(xué)技術(shù)，特別是高通量基因測(cè)序的發(fā)展，miRNA 的作用已出現(xiàn)在各種生物學(xué)過程中，如細(xì)胞分化、凋亡、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄后翻譯修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。此外，miRNA 在大多數(shù)基因調(diào)控途徑的轉(zhuǎn)錄后水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過改變免疫應(yīng)答在AD 甚至腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［13］。

2 miRNA在AD中的作用及研究現(xiàn)狀

miRNA 在先天免疫的不同方面發(fā)揮重要作用，如控制并殺死微生物、介導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。此外，miRNA 也被確認(rèn)在不同類型的效應(yīng)性T 輔助細(xì)胞亞群，如T 輔助細(xì)胞（Th1、Th2、Th17、Th9）、濾泡性T 輔助細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。這些效應(yīng)性T輔助細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中可誘導(dǎo)和抑制miRNA 表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生促炎或抗炎作用，因此，它們是炎癥的關(guān)鍵調(diào)控因子［14］。一些細(xì)胞因子，如IFN-γ 和IL-17 在T 細(xì)胞中產(chǎn)生，負(fù)責(zé)Th1 和Th17 的分化，已被證明參與AD 的病理過程［15］。miRNA 是正常免疫T 細(xì)胞功能所必需的，一些特定的miRNAs與T細(xì)胞的功能或發(fā)育直接或間接相關(guān)，包括CD8+T 細(xì)胞（miR-150、miR-21 和miR-155）、Th2（miR-150 或miR-146a）、Th1（miR-147 或miR-155）和Th17等［16］。

在免疫細(xì)胞發(fā)育過程中，miRNA 調(diào)控紊亂可能導(dǎo)致AD 發(fā)生。例如，miR-155 在MS 中高表達(dá)［17］；miR-146a 在T1DM 及SLE 中均顯著下調(diào)［18］；miR-21在MS 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中表達(dá)增加，與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-21 缺陷型小鼠對(duì)EAE 的發(fā)生具有抵抗性［19-20］。另外，在牛皮癬及炎癥性腸病患者中也發(fā)現(xiàn)miR-21 表達(dá)增加［21］。除以上幾種miRNAs 外，還有其他miRNAs 通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞分化在自身免疫中發(fā)揮重要作用，如miR-27a 可抑制Th17 分化，因而在MS 中被下調(diào)［22］。還有研究者提出，miR-140-5p 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT1 的激活來抑制Th1分化，從而提供了針對(duì)MS 發(fā)生的保護(hù)作用［23］。然而，大多數(shù)miRNAs 在體內(nèi)的功能是未知的，研究miRNA 在AD 中的作用不僅有助于了解這些疾病的發(fā)病機(jī)制，而且有助于探尋預(yù)防和治療這類嚴(yán)重疾病的方法。

3 miR-326的概述

miR-326是含有20個(gè)由11號(hào)染色體內(nèi)含子1編碼的核苷酸，最初被鑒定為神經(jīng)元中的一種神經(jīng)特異性miRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控宿主基因組表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)可能與抑制素基因（β基因）表達(dá)呈正相關(guān)［24］。近年來，miR-326得到了廣泛研究，其在免疫穩(wěn)態(tài)的成熟、分化和維持等過程中發(fā)揮重要作用［25-26］。生物信息學(xué)研究顯示miR-326 的靶基因有整合素金屬蛋白酶17（ADAM17）、CD47、Ets-1、GLI1、IL-17、丙酮酸激酶M2（PKM2）、PTEN、維生素D3 受體（VDR）等［27］。在miR-326 介導(dǎo)的AD 中，VDR、CD47、Ets-1 是研究最為廣泛的3 種靶基因。其中，VDR 參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持，miR-326 基因過表達(dá)可抑制免疫細(xì)胞中VDR的表達(dá)進(jìn)而誘發(fā)某些AD 發(fā)生［3］；CD47 作為一種跨膜蛋白，在控制和遷移巨噬細(xì)胞吞噬中起主要作用，這種作用在一些AD中能夠促進(jìn)Th17的分化［28］；Ets-1 是一種可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)節(jié)淋巴樣細(xì)胞分化和增殖。Ets-1 參與調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細(xì)胞的平衡，是Th17 分化的反向調(diào)節(jié)因子，其通過自身表現(xiàn)的“抗miR-326”屬性而被視為miR-326的功能靶標(biāo)［29］。此外，KEFAS 等［30-31］發(fā)現(xiàn)miR-326 通過靶向調(diào)控Notch1/2 及PKM2 從而削弱多種細(xì)胞的增殖和侵襲。而M?LLER 等［32］認(rèn)為miR-326 與Notch 是以負(fù)反饋的方式相互調(diào)節(jié)，即miR-326 直接調(diào)節(jié)Notch-1的表達(dá)，而其本身又可受到反饋環(huán)路的調(diào)節(jié)。miR-326 下調(diào)可能改變細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和代謝活性這一理論還需深入研究。此外，Wnt 信號(hào)通路也被認(rèn)為與AD 密切相關(guān)［33］，然而，miR-326 與Wnt 信號(hào)通路在介導(dǎo)AD 的發(fā)病中是否存在聯(lián)系，仍有待進(jìn)一步證明。

4 miR-326在AD中的研究

4.1 miR-326與MS MS是一種慢性炎癥性脫髓鞘中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其機(jī)制是由于人體免疫系統(tǒng)異常攻擊神經(jīng)髓鞘，引起炎癥及相關(guān)損傷，進(jìn)而破壞大腦、視神經(jīng)和脊髓的正常功能，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能惡化［34］。DU 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，miR-326 的表達(dá)與MS 患者和EAE 小鼠的疾病嚴(yán)重程度高度相關(guān)，在體內(nèi)沉默miR-326 可導(dǎo)致Th17 減少和EAE 減輕，而其過表達(dá)可導(dǎo)致Th17細(xì)胞增殖和EAE癥狀加重，這可能是由于miR-326 通過靶向調(diào)控Th17 細(xì)胞分化的負(fù)性調(diào)控因子Ets-1，從而促進(jìn)了Th17 細(xì)胞分化。miRNA 表達(dá)譜分析顯示，在MS 患者的PBMC、全血、血清中miR-326 水平均可能發(fā)生改變［35］。然而，MATHEW 等［36］分析了59例MS患者和37例健康對(duì)照者外周血樣本中27 種miRNAs 的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-326 的表達(dá)在MS 病例組及健康對(duì)照組中無明顯差別。此外，MOHAMMAD 等［37］認(rèn)為miR-326可用于區(qū)分MS的復(fù)發(fā)期和緩解期，且miR-326可通過影響TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化。綜上，miR-326 的表達(dá)水平可能預(yù)測(cè)MS 的發(fā)病，其靶基因Ets-1在其中發(fā)揮重要作用，但其分子機(jī)制及其與其他炎癥相關(guān)通路的關(guān)系仍未完全闡明，且miR-326 的其他靶基因是否也參與MS 的發(fā)病有待深入研究。

4.2 miR-326 與T1DM T1DM 是一種多基因參與的AD，其特征是自身免疫反應(yīng)攻擊胰島β細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌不足。VDR 由大量免疫細(xì)胞，如活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生，VDR 多態(tài)性導(dǎo)致的VDR 功能改變已被引入包括T1DM 等AD 的發(fā)病機(jī)制中［38］。SEBASTIANI 等［3］在一項(xiàng)針對(duì)19 例T1DM 患者的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-326 過表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞中VDR 下調(diào)；ZIPITIS 等［39］研究發(fā)現(xiàn)與未補(bǔ)充維生素D（VD）的嬰兒相比，補(bǔ)充VD 的嬰兒長(zhǎng)大后罹患T1DM 的風(fēng)險(xiǎn)降低29%，且在T1DM 動(dòng)物模型中使用高劑量VD 或VD 類似物時(shí)，可預(yù)防糖尿病或抑制其進(jìn)展。此外，有研究報(bào)道抑制肌營(yíng)養(yǎng)蛋白基因（Mtpn）會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌減少，AZHIR 等［40］研究表明，miR-326過表達(dá)可能導(dǎo)致Mtpn表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，miR-326過表達(dá)可能通過促進(jìn)Th17細(xì)胞分化進(jìn)而參與T1DM 的致病性。因此，進(jìn)一步探索miR-326 與VDR、Mtpn 對(duì)Th17 細(xì)胞的影響，有望闡明T1DM 的發(fā)病機(jī)制，并為靶向治療甚至預(yù)防T1DM 提供有效策略。

4.3 miR-326 與SLE SLE 是一種慢性、多系統(tǒng)性、復(fù)雜的AD，可影響多個(gè)組織和器官，且具有不同的臨床表現(xiàn)［41］。盡管尚未闡明SLE 的確切病因，但遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌和其他因素可能在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［42］。T 淋巴細(xì)胞不僅可通過直接接觸影響其他免疫細(xì)胞，還可通過分泌促炎癥細(xì)胞因子并直接作用于靶組織來參與SLE 發(fā)展，但其與miR-326的關(guān)系有待證明［43］。此外，B淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是SLE 發(fā)病的主要參與者，XIA 等［44］認(rèn)為MRL/lpr小鼠中的miR-326 過表達(dá)可導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞過度活化和嚴(yán)重的SLE。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SLE中B淋巴細(xì)胞內(nèi)升高的miR-326 通過下調(diào)Ets-1 促進(jìn)漿細(xì)胞發(fā)育和抗體產(chǎn)生。CHEN 等［45］在一項(xiàng)針對(duì)8 例SLE 患者的研究中發(fā)現(xiàn)其miR-155、miR-223、miR-224、miR-326 及miR-342 表達(dá)均升高。此外，SUN 等［4］通過一項(xiàng)針對(duì)53例SLE 患者的研究中描述了miR-326過表達(dá)可導(dǎo)致Ets-1 mRNA 水平降低。綜上，miR-326 的表達(dá)水平可能與SLE 癥狀呈正相關(guān)，理論上，通過靶向抑制miR-326 的表達(dá)進(jìn)而有效抑制SLE 患者體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，有望使SLE 取得滿意療效。然而，這有待通過完善SLE 動(dòng)物模型及設(shè)計(jì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

4.4 miR-326 與AIT AIT 是最常見的AD 之一，橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）是一種主要的AIT，HT 的病理特征是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和甲狀腺濾泡組織病變，HT患者的血清循環(huán)甲狀腺抗體主要是抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAbs）和甲狀腺球蛋白抗體（TgAbs），可導(dǎo)致甲狀腺纖維化或萎縮并伴有甲狀腺功能減退［46］。ZHAO 等［5］通過建立碘誘導(dǎo)的AIT小鼠模型證明miR-326高表達(dá)可使Th17顯著增加，且miR-326抑制Ets-1蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，最終促進(jìn)碘化物誘發(fā)AIT。LIU 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，HT 患者miR-326 表達(dá)水平升高，隨著PBMC中miR-326的過表達(dá)，Th17細(xì)胞的分化得以增強(qiáng)，與此同時(shí)，HT 患者的ADAM17 表達(dá)降低，基于以上發(fā)現(xiàn)，miR-326 可能通過靶向抑制ADAM17 參與HT 發(fā)病。提示深入研究miR-326 介導(dǎo)ADAM17 與Ets-1的表達(dá)關(guān)系是靶向治療HT 的新思路。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)AIT 患者還經(jīng)常患有其他AD，如T1DM、SLE、慢性自身免疫性胃炎等［47］，提示miR-326 介導(dǎo)AD 發(fā)病可能存在共同通路，且其他AD 的發(fā)病機(jī)制研究有望為AIT的研究提供新依據(jù)。

4.5 miR-326 與ITP ITP 是一種自身免疫介導(dǎo)的血小板破壞和血小板生成受損的AD。目前，miR-326參與ITP的發(fā)病機(jī)制還處于初步探索階段，其表達(dá)水平可能與ITP 嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。LIU 等［7］在46 例ITP 患者和39 例健康對(duì)照者的Th 細(xì)胞亞群中的研究顯示，ITP 患者中miR-146a、miR-326 和miR-142-3p 表達(dá)減少。值得注意的是，miR-326 被證實(shí)可通過在體外儲(chǔ)存單采血小板的方式調(diào)節(jié)抗凋亡基因（Bcl-xL）在血小板中的表達(dá)［48］。表明Bcl-xL 也可能是miR-326 的靶基因，且過表達(dá)miR-326 有望治療ITP，二者在ITP 中的作用值得深入研究。同時(shí)，上調(diào)miR-326 在其他AD 中的副作用也不容忽視。此外，萬紅等［49］研究證實(shí)，漢族人群PTPN22、TNF-α 基因多態(tài)性均可影響ITP 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其中PTPN22 的1 123 位點(diǎn)G 突變、TNF-α 863 位點(diǎn)A 突變等均是ITP的危險(xiǎn)因素，這些突變是否與miR-326的異常表達(dá)相關(guān)有待繼續(xù)深入研究。

5 miR-326與腫瘤等其他疾病

研究證實(shí)miR-326通過抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抑癌作用。miR-326 作為腫瘤抑制因子參與了如非小細(xì)胞肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等的形成和進(jìn)展［50-52］。例如miR-326 還可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲［50］；miR-326 可靶向抑制MAPK/MEK 信號(hào)通路的激活，從而影響食管鱗狀癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡［51］；且miR-326 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平降低，并可能調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的代謝活性［52］。提示miR-326有望成為多種腫瘤的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，但如何平衡miR-326 在抗腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)可能誘導(dǎo)AD 的產(chǎn)生，無疑是未來研究的難點(diǎn)與突破點(diǎn)。此外，miR-326 在膿毒血癥患者中也存在異常表達(dá)［53］，這些都為深入研究miR-326 在AD 中的作用提供了更多方向。

6 展望

綜上所述，miR-326 與AD 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其表達(dá)水平和介導(dǎo)的靶基因在不同AD 中各有差異，深入研究miR-326與其各類靶基因在AD中的作用，有望為AD 的靶向治療提供新依據(jù)，然而，目前miR-326在AD中的研究還處于初步探索階段，仍有待通過完善AD 動(dòng)物模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)一步闡明。此外，值得注意的是，因?yàn)閙iR-326的腫瘤抑制作用，下調(diào)其表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖。因此，探究miR-326在介導(dǎo)AD中的敏感靶基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是未來重要的研究方向。