超聲響應(yīng)下載藥納米材料在腫瘤靶向治療中應(yīng)用研究進(jìn)展

朱江 王敏言

近年來(lái)，使用非侵入性手段刺激特定刺激響應(yīng)納米材料來(lái)輔助腫瘤靶向治療已經(jīng)成為了一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。常用的非侵入性物理刺激有4種類型：超聲波、光、電場(chǎng)和磁場(chǎng)。刺激響應(yīng)納米材料可以用于輔助藥物遞送、癌癥治療和組織工程。非侵入性物理刺激和刺激響應(yīng)納米材料的結(jié)合可以增加藥物在靶組織積累及釋放的可控性，降低藥物的非特異毒性，提高藥物的傳遞效率，帶來(lái)更好的治療效果。筆者將專注于超聲波控制藥物釋放在癌癥治療中的作用，就超聲波作為刺激源的原理、超聲波對(duì)材料的影響，以及如何與納米材料協(xié)同作用作一述評(píng)。

1 超聲波的定義與發(fā)展歷史

1.1 超聲波的定義 聲波是由物體振動(dòng)產(chǎn)生的一種機(jī)械波，每秒的振動(dòng)次數(shù)稱為頻率，人耳可聞及的頻率范圍為16～20 kHz。超過(guò)人耳聽覺(jué)閾值即頻率＞20 kHz的聲波為超聲波，簡(jiǎn)稱超聲[1]。

1.2 超聲波的發(fā)展歷史 19世紀(jì)40年代，維也納大學(xué)的神經(jīng)學(xué)專家Dussik等[2]通過(guò)超聲波透過(guò)顱骨診斷腦損傷和定位腦室后，超聲波開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷。而早在超聲波用于醫(yī)學(xué)診斷之前，就發(fā)現(xiàn)其具有治療能力。1927年Wood等[3]描述了超聲波治療后組織的持久變化。20世紀(jì)40年代，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的Lynn等[4]提出用超聲波加熱治療的建議。到20世紀(jì)70年代末，超聲波的熱效應(yīng)廣泛應(yīng)用于癌癥的靶向治療。高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound,HIFU）治療腫瘤的主要機(jī)制，即超聲波的熱效應(yīng)，近20年來(lái)HIFU已經(jīng)成為了傳統(tǒng)腫瘤治療的替代方案之一。

2 超聲生物學(xué)效應(yīng)

超聲生物學(xué)效應(yīng)是超聲波治療的基礎(chǔ)。超聲波作用于人體會(huì)產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，主要包括熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，其中非熱效應(yīng)又包括空化效應(yīng)和超聲輻射力。

2.1 熱效應(yīng) 每當(dāng)超聲波傳播到諸如組織之類的物質(zhì)中時(shí)，波的幅度會(huì)隨著距離的增加而減小，這種衰減是由于吸收或散射造成的。吸收是一種機(jī)械能轉(zhuǎn)化為熱能的一種機(jī)制，散射被認(rèn)為是改變波傳播方向的機(jī)制。因?yàn)榻橘|(zhì)可以吸收能量來(lái)產(chǎn)生熱量，所以只要產(chǎn)生熱量的速度大于熱量排出的速度，溫度就會(huì)升高[5-7]。一定強(qiáng)度的超聲波在人體內(nèi)傳播時(shí)，超聲波的能量被組織吸收，較高的能量沉積（＞55℃）會(huì)引起組織細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固、變性和壞死，這是HIFU治療的主要工作原理，較低的能量沉積（＜55℃）可以誘導(dǎo)細(xì)胞通透性增加，從而加強(qiáng)納米級(jí)別的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，加強(qiáng)超聲激發(fā)療法的療效[8]。

2.2 非熱效應(yīng)

2.2.1 空化效應(yīng) 空化效應(yīng)是指在超聲波作用下，液態(tài)介質(zhì)中的微小氣泡被激活后，產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及內(nèi)爆等一系列復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，這被認(rèn)為是促進(jìn)藥物靶向輸送的主要機(jī)制[9-10]?？栈?yīng)可以分為慣性空化和穩(wěn)定空化。

慣性空化是當(dāng)微氣泡在聲學(xué)循環(huán)的一部分期間膨脹，然后由于不規(guī)則振蕩和空腔的快速增長(zhǎng)而迅速塌陷的過(guò)程，這導(dǎo)致微氣泡碎裂成多個(gè)更小的微泡。在微氣泡崩塌期間，流體中會(huì)產(chǎn)生沖擊波，形成微射流。有研究證明，沖擊波和微射流會(huì)產(chǎn)生非常大的力，可以穿透細(xì)胞膜，甚至滲透血管[11-12]。沖擊波、微射流及隨后的聲孔效應(yīng)都可以誘導(dǎo)細(xì)胞攝取小分子和高分子量的藥物。穩(wěn)定空化是指微氣泡在低聲壓下對(duì)稱性壓縮和膨脹，氣泡直徑保持相對(duì)恒定而不破裂，這種穩(wěn)定的振蕩會(huì)在微氣泡周圍產(chǎn)生液體流，即“微流束”[13]。當(dāng)這些振動(dòng)的微氣泡靠近細(xì)胞時(shí)，會(huì)對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生剪切應(yīng)力。剪切應(yīng)力水平在很大程度上取決于超聲波參數(shù)，其參數(shù)范圍一般在100～1 000 Pa[14]。這些穩(wěn)定的振蕩也可能促進(jìn)大分子藥物和納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)輸送。Forbes等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，在低于慣性空化閾值強(qiáng)度的聲波暴露下，細(xì)胞可攝取異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐，相比之下，穩(wěn)定空化微泡需要與細(xì)胞直接接觸才能影響細(xì)胞膜，慣性空化微泡的影響范圍更大。

2.2.2 超聲輻射力 超聲波對(duì)位于其傳播路徑上的吸收或反射體會(huì)產(chǎn)生一種具有單一方向的作用力，這就是超聲輻射力[17-18]。超聲輻射力可分為主輻射力和次輻射力。前者能改善藥物和基因載體沿波傳播方向向血管外滲漏，后者效應(yīng)會(huì)增加單個(gè)氣泡之間的振蕩、相互吸引和聚集。脈沖HIFU產(chǎn)生的輻射力可以選擇性地促進(jìn)脂質(zhì)體阿霉素（doxorubicin,DOX）[19]、對(duì)比劑[20]和裸DNA[21]的傳遞。

3 超聲激發(fā)載藥納米粒在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用

3.1 靶向傳遞化療藥物 20世紀(jì)80年代，熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Matsumura等[22]發(fā)現(xiàn)腫瘤血管對(duì)大分子化合物具有高度的滲透性，這些大分子化合物進(jìn)入腫瘤組織后，會(huì)在腫瘤組織內(nèi)滯留較長(zhǎng)時(shí)間，他們用“增強(qiáng)通透性和保留效應(yīng)”（enhanced permeability and retention effect,EPR effect）這一術(shù)語(yǔ)來(lái)描述實(shí)體瘤血管系統(tǒng)的獨(dú)特病理生理現(xiàn)象。EPR effect是化療藥物被動(dòng)靶向的基礎(chǔ)，而超聲波可以作為一種相對(duì)無(wú)害的非侵入性刺激，以增強(qiáng)癌癥化療藥物的作用，而且可以在特定部位實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)超聲與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，能加強(qiáng)被動(dòng)靶向作用。早在1982年，Hahn[23]試圖確定熱效應(yīng)是否會(huì)影響博來(lái)霉素對(duì)小鼠的輻射誘導(dǎo)纖維肉瘤（radiationinduced fibrosarcoma,RIF）的療效。他們通過(guò)水浴加熱、射頻輻射和超聲波熱療誘導(dǎo)3種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)熱療，結(jié)果表明通過(guò)超聲波熱療誘導(dǎo)的治愈率最高。2002年，F(xiàn)eril等[24]回顧了超聲波在增強(qiáng)抗腫瘤藥物療效方面的應(yīng)用，并回顧了一系列研究，這些研究報(bào)道了在升溫不明顯的情況下增強(qiáng)抗腫瘤藥物效應(yīng)。他們提出了一些可能的機(jī)制：（1）超聲波誘導(dǎo)細(xì)胞膜通透性增加；（2）超聲波誘導(dǎo)靶細(xì)胞對(duì)相關(guān)藥物的敏感性增加；（3）超聲波誘導(dǎo)藥物修飾；（4）超聲波或藥物單獨(dú)引起的局部損傷，這些機(jī)制綜合作用下導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

為了進(jìn)一步增強(qiáng)化療藥物的靶向作用，超聲波控制的藥物遞送平臺(tái)不斷被開發(fā)。Dromi等[25]利用脈沖高強(qiáng)度聚焦超聲（pulsed high-intensity focused ultrasound,p-HIFU）的熱效應(yīng)聯(lián)合熱敏脂質(zhì)體，在小鼠上實(shí)現(xiàn)DOX靜脈注射后于腫瘤處局部釋放，與單獨(dú)給藥或非熱敏脂質(zhì)體載藥相比，p-HIFU聯(lián)合熱敏脂質(zhì)體載藥有效利用了脂質(zhì)體和熱療的雙重優(yōu)勢(shì)，顯著增加DOX傳遞的效率，降低腫瘤生長(zhǎng)速率。Rapoport等[26]通過(guò)將全氟戊烷與聚合物膠束包裹在一起，制備了負(fù)載DOX的聲敏（相變）納米顆粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生理溫度下，液體納米液滴轉(zhuǎn)化為微米級(jí)氣體；DOX穩(wěn)定地保留在微泡中，但在超聲波照射下釋放；同時(shí)，微泡的空化效應(yīng)增加了腫瘤細(xì)胞的藥物攝取。

微泡最初被設(shè)計(jì)用于輔助超聲診斷，但超聲的空化效應(yīng)為其提供了許多可能性。大多數(shù)微泡的直徑約為2～8 μm，因此可以在整個(gè)血管系統(tǒng)中自由循環(huán)。微泡制劑一般由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物組成的外殼，由空氣、六氟化硫（sulfur hexafluoride,SF6）或更常見(jiàn)的氟化碳?xì)怏w內(nèi)核組成。部分微泡使用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）等試劑進(jìn)一步穩(wěn)定脂質(zhì)殼，這也有助于逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system,RES）的吞噬，從而延長(zhǎng)在血液中循環(huán)時(shí)間[27]。作為超聲響應(yīng)納米級(jí)材料，由于其物理特性，基于微泡的藥物可以實(shí)現(xiàn)超聲實(shí)時(shí)監(jiān)控下的腫瘤治療。這樣非侵入性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法能應(yīng)對(duì)不同腫瘤結(jié)構(gòu)或手術(shù)治療禁忌等情況提出的挑戰(zhàn)。為了增強(qiáng)微泡在靶組織的有效積累，有研究進(jìn)一步開發(fā)了基于微泡分子水平的靶向藥物遞送系統(tǒng)。Wu等[28]研究證實(shí)，A10-3.2靶向前列腺特異性膜抗原的適配體偶聯(lián)的納米泡（nanometer bubbles,NBs）形成前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）特異性的靶向超聲對(duì)比劑，對(duì)人前列腺癌荷瘤裸鼠模型中過(guò)度表達(dá)的PSMA存在特異性。

超聲波控制的藥物遞送平臺(tái)達(dá)到提高局部藥物或基因的濃度、使藥物避免被肝臟攝取、延緩藥物釋放、減少給藥次數(shù)、減小給藥劑量、增加藥物療效和減輕全身不良反應(yīng)的目的。

3.2 靶向傳遞基因 基因治療是將正?；?qū)氚袇^(qū)域組織細(xì)胞來(lái)糾正或補(bǔ)償異?；蛉毕莼?，以達(dá)到治療疾病的目的[29]。在上述方法中，超聲結(jié)合微泡、脂質(zhì)體等超聲響應(yīng)納米?？梢詾榉乔秩胄钥刂扑幬镌隗w內(nèi)特定靶點(diǎn)沉積提供基礎(chǔ)?；蛑委煶晒Φ年P(guān)鍵在于：（1）治療性核酸必須有效地輸送到所需的作用部位；（2）治療性核酸到靶部位后，必須通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸入該部位的靶細(xì)胞。本質(zhì)上，這些挑戰(zhàn)與以上提到增強(qiáng)癌癥化療藥物作用的超聲波控制藥物遞送平臺(tái)類似。迄今為止，大多數(shù)基因治療采用方法是使用基于病毒的載體系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)治療性核酸向靶細(xì)胞的遞送，因?yàn)椴《咎峁┝诉M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間的理想方法。然而，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，病毒載體系統(tǒng)可能對(duì)患者造成嚴(yán)重不利影響，其中包括引發(fā)不良免疫反應(yīng)以及與癌基因啟動(dòng)子/基因附近的序列整合相關(guān)的挑戰(zhàn)[30-31]。

超聲介導(dǎo)的基因傳遞是治療癌癥的一個(gè)極具吸引力的選擇，微泡和脂質(zhì)體都能作為超聲介導(dǎo)基因傳遞的有效載體。微泡被設(shè)計(jì)成直接將DNA結(jié)合在其外殼上或在其核心包含遺傳物質(zhì)。在這樣的系統(tǒng)中，微泡既是空化核又是血管內(nèi)基因載體系統(tǒng)。

Wu等[32]使用siRNA與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）結(jié)合的靶向納米泡聯(lián)合低頻超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）有效轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞（hepatocellular carcinoma,HCC）。結(jié)果表明，這些納米泡有良好的靶向HCC的能力，并且顯著提高了HCC中神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因1（neuroepithelial cell transforming gene 1,NET-1）的沉默。

也有報(bào)道稱，由于DNA和RNA的磷酸骨架為負(fù)電性，陽(yáng)離子微泡（cationic microbubbles,CMBs）可以增強(qiáng)DNA的承載能力。Kopechek等[33]將帶有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）誘餌的陽(yáng)離子脂質(zhì)用微泡包裹輸送到鱗狀細(xì)胞癌中，在超聲波輻射下，STAT3信號(hào)在體外和體內(nèi)均受到抑制，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低下游靶基因表達(dá)。Xu等[34]聯(lián)合UTMD和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA），明顯抑制MCF-7細(xì)胞系中異黏蛋白（metadherin,MTDH）的表達(dá)，從而降低細(xì)胞活力，減少細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），進(jìn)一步證明了超聲波可以非侵入性地促進(jìn)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移以及微泡的存在顯著影響了基因表達(dá)。

總之，超聲波介導(dǎo)下的基因傳遞在基因療法治療癌癥方面具有巨大的潛力。超聲波可以在基因表達(dá)或抑制方面提供一種時(shí)間、空間特異性的外部刺激，可作為單獨(dú)治療手段，也可以基于化療，提供進(jìn)一步的個(gè)體化治療。

3.3 聲動(dòng)力療法（sonodynamic therapy,SDT） SDT這個(gè)術(shù)語(yǔ)源于光動(dòng)力療法。然而，與光動(dòng)力療法光敏劑直接由光激發(fā)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species,ROS）不同，SDT是通過(guò)超聲波誘導(dǎo)的空化和聲敏劑介導(dǎo)產(chǎn)生自由基，殺死附近快速分裂的癌細(xì)胞?？梢?jiàn)光在組織中衰減迅速，穿透性有限，只能在表面或術(shù)中使用，但聲波可以到達(dá)組織深部，更具應(yīng)用潛力，但是SDT的機(jī)制仍未明確。目前最有說(shuō)服力的解釋是：ROS是由超聲波引起的空化效應(yīng)產(chǎn)生，其次是聲致發(fā)光和熱解。在超聲波的輻射下，氣泡會(huì)成核、生長(zhǎng)、爆炸，也就是空化效應(yīng)，氣泡爆炸中產(chǎn)生的能量會(huì)產(chǎn)生光，產(chǎn)生“空穴-電子”對(duì)，繼而產(chǎn)生ROS或激活聲敏劑，通過(guò)系統(tǒng)間交叉（intersystem crossing,ISC）產(chǎn)生ROS[35]?？栈?yīng)能產(chǎn)生巨大的能量，但是能量在局部釋放和冷卻速度快，在臨近組織中的不良反應(yīng)很小。這個(gè)過(guò)程中，聲敏劑可能被分解成自由基，顯著增強(qiáng)治療效果，它們被認(rèn)為是SDT的重要組成部分。在過(guò)去的幾十年中已經(jīng)開發(fā)不同類型的聲敏劑有：有機(jī)分子[36-39]、無(wú)機(jī)納米材料[40-41]、雜化物[42]和金屬基系統(tǒng)[43-44]等。大多數(shù)聲敏劑都有疏水性，容易在生理環(huán)境中發(fā)生聚集，從而影響其藥代動(dòng)力學(xué)特性。借助納米技術(shù)，使用聲敏劑聯(lián)合超聲可以有力克服這些限制。封裝的納米粒子可以作為聲敏劑，提高SDT效率。此外納米粒子通過(guò)降低空化閾值，為空化泡的產(chǎn)生提供了更多的成核位點(diǎn)。卟啉類似物如4-甲基苯基卟啉（tetraphenylporphyrin,TTP）、血卟啉單甲醚（hematoporphyrinmonomethyl ether,HMME）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin IX,PpⅨ），在SDT中獲得了較多的關(guān)注，例如Ma等[36]使用猛（manganese,Mn）、鋅（zinc,Zn）、二氧化鈦（titanium dioxide,TiO2）3種金屬及金屬氧化物合成了金屬卟啉配合物：Mn-TTP、Zn-TTP和TiO2-TTP，并使用人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）包被配合物，可以在11 cm的深層組織中表現(xiàn)出優(yōu)異的超聲激活能力。除此之外，無(wú)機(jī)納米聲敏劑在體外超聲誘導(dǎo)SDT效應(yīng)方面也具有較高的穩(wěn)定性，其中基于TiO2半導(dǎo)體納米聲納傳感器已在癌癥治療中得到探索。Deepagan等[45]開發(fā)了親水性Au-TiO2納米復(fù)合材料（HAu-TiO2NCs）作為改進(jìn)SDT的聲敏劑。他們研究了HAu-TiO2納米碳素的物理化學(xué)性質(zhì)，并與未沉積金的納米碳素進(jìn)行了比較。HAu-TiO2NCs經(jīng)超聲照射后產(chǎn)生大量ROS，在體內(nèi)系統(tǒng)給藥后可完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些研究結(jié)果提示，聲動(dòng)力療法可能在未來(lái)給癌癥的靶向治療提供一個(gè)替代方案。

綜上所述，超聲波激發(fā)的藥物遞送平臺(tái)在臨床藥物遞送治療和提高治療效果方面有獨(dú)特的應(yīng)用前景。本文描述了超聲激發(fā)載藥納米粒在腫瘤治療中的各種應(yīng)用策略，但盡管超聲激發(fā)療法已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但在臨床實(shí)踐中仍有許多困難需要解決，例如介質(zhì)作為外來(lái)物質(zhì)，容易引起體內(nèi)免疫反應(yīng)，其次介質(zhì)的靶向性需要進(jìn)一步增強(qiáng)，另外介質(zhì)在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)也需要被研究者們研究。希望這些問(wèn)題能夠隨著未來(lái)超聲激發(fā)療法的進(jìn)一步研究而得到解決。