輻照處理對樺褐孔菌多糖抗疲勞作用的影響

路欣彤，齊 欣，高雪峰 ，崔承弼,,

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 133000；3.延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林延吉 133000）

疲勞是人體非常復(fù)雜的生理狀態(tài)，隨著社會壓力的增大，許多人的身體處于一種亞健康的狀態(tài)[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，在多發(fā)性硬化癥、腦出血以及神經(jīng)肌肉等疾病中，疲勞患者的患病率會增加[2]。首先，肌肉疲勞是由于乳酸和尿素氮等代謝物的過度產(chǎn)生和積累導(dǎo)致的[3]；其次，肌肉或其他相關(guān)器官（如肝臟）中活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激和對身體的損害，最終機體在無氧運動狀態(tài)下，通過糖酵解反應(yīng)獲取能量，此運動下產(chǎn)生乳酸，乳酸含量的增多，導(dǎo)致疲勞狀況的發(fā)生[4]。一些化學(xué)藥物和天然草藥，如黃芪、蛹蟲草和紅景天等[5]均已被報道具有抗疲勞作用。因此，有必要對天然抗疲勞的活性物質(zhì)進(jìn)行研究與開發(fā)[6]。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus），屬于多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種藥食兩用的木腐菌[7]，又名樺樹茸、西伯利亞靈芝[8]等，無任何毒副作用，主要產(chǎn)于北緯45°～50°的俄羅斯、吉林長白山、日本北海道等地[9-11]。樺褐孔菌中，多糖是其主要的活性成分[12]。目前，來自于各種植物、動物、微生物的多糖，因純天然、藥理活性強、無毒副作用、易于藥物質(zhì)量控制等優(yōu)點[13]而受到廣泛重視，是一種潛在的保健功能成分。此外，許多研究表明，樺褐孔菌含有200多種活性物質(zhì)，其含有的多糖、樺褐孔菌素、三萜類化合物等，具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗疲勞、促進(jìn)益生菌增殖等功效[14-16]。

樺褐孔菌因外界吸收了化學(xué)物質(zhì)成分而導(dǎo)致其在長期的保存和加工過程中營養(yǎng)成分受到影響，一些有機生物的物質(zhì)成分也發(fā)生變化，所以必須對其進(jìn)行凈化處理[17]。輻照是一種新興的食品保鮮技術(shù)，目的是提高食品安全[18-19]。主要運用在殺菌誘變等方面[20]，60Co產(chǎn)生的γ-射線可以與食品相互作用使其發(fā)生生理生化反應(yīng)或生物效應(yīng)，可通過這種輻照方式提高食品中活性物質(zhì)各方面的特性[21]。食品經(jīng)過輻照處理后，對于微量元素、氨基酸、蛋白質(zhì)以及糖類損失較少，達(dá)到消滅食品或農(nóng)產(chǎn)品中的微生物，如病毒、細(xì)菌等的目的。此外，輻照有助于提高衛(wèi)生和安全性[22]。陳浙婭等[23]研究輻照對裂褶菌多糖提取、分子量及生物活性的影響，發(fā)現(xiàn)在一定劑量范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的增加，裂褶菌多糖的提取率和純度有顯著增加。因此，本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上將選定最優(yōu)輻照劑量，選擇經(jīng)60Co-γ射線輻照后的樺褐孔菌與未輻照樺褐孔菌制得多糖，研究其對小鼠的抗疲勞效果，為輻照樺褐孔菌多糖在抗疲勞方面的開發(fā)與利用提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠30只，體重（19±1）g 延邊大學(xué)動物實驗中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2009-0003）；樺褐孔菌干樣 長白山科學(xué)研究院提供并于四川省原子能研究院進(jìn)行輻照處理；乙醇（85%）、濃硫酸（98%） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖粉劑 廣西梧州制藥（集團）股份有限公司；MDA、SOD、SUN試劑盒、糖原測試盒、乳酸（LD）測試盒、乳酸脫氫酶 （LDH）測試盒 南京建成生物工程研究所。

60Co-γ輻照源 四川省原子能研究院；DF-35型落地式連續(xù)投料粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; ScoutSE-SE202FZH型電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司；TG16A-WS型離心機 上海盧湘儀器有限公司；CCA-1111-CE 型旋蒸冷凝器 東京理化器械株式會社；LyoQuest-55實驗型冷凍干燥機西班牙Telstar 集團公司；DTC-22B型真空泵 日本ULUACKIKO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌材料處理 將樺褐孔菌破碎，用40目型粉碎機進(jìn)行粉碎成樺褐孔菌粉末。將樺褐孔菌粉末送至四川省原子能研究院進(jìn)行輻照處理，以60Co-γ射線為輻照源，根據(jù)前期實驗設(shè)計輻照劑量分別設(shè)為 5、 10、20、30 kGy，每組樺褐孔菌劑量率均為 1 kGy/h，輻射距離 37 cm，平鋪厚度3 mm，重鉻酸鉀劑量計進(jìn)行劑量追蹤，輻照時間分別為 5、10、20、30 h，重復(fù)三次。輻照處理后的樺褐孔菌置于冰箱冷藏室內(nèi) 4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樺褐孔菌多糖的提取 根據(jù)多項研究證實，使用乙醚或乙醇等有機溶液，可以脫去多糖中的脂類，防止多糖降解及含量的減少[24]。利用熱水浸提法，取不同輻照劑量（5、10、20、30 kGy）樺褐孔菌菌粉各10 g分別放入四個燒杯中，未輻照的樺褐孔菌菌粉10 g放入一個燒杯中，分別加入85%的乙醇（500 mL）并充分混合，80 ℃水浴2.5 h，冷卻達(dá)到室溫，3500 r/min離心5 min，抽濾取清液后旋蒸，置于平皿中充分凍干，即得粗多糖粉末。

1.2.3 最優(yōu)輻照劑量的選定

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 稱取葡萄糖粉末5 mg，定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的母液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液，后在各個燒杯中分別進(jìn)行如下操作：用蒸餾水填補到1 mL，加苯酚0.6 mL，濃硫酸3.6 mL，混合均勻，100 ℃水浴顯色20 min，降至室溫并測得490 nm處的OD值，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 輻照劑量選定 樺褐孔菌經(jīng)過提取過程獲得多糖粉末后，稱量輻照后的樺褐孔菌多糖粉末和未輻照粉末各1 mg，分別進(jìn)行以下操作：使用蒸餾水定容至10 mL，混合試劑后，取1 mL，加入苯酚和濃硫酸，全部混合，高溫水浴20 min，降至室溫并測得490 nm處的OD值。測定樺褐孔菌多糖含量，確定最佳輻照劑量。

1.2.4 實驗動物分組及給藥 選取體重（19±1）g的SPF級雄性昆明種小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按照體重隨機分成5組，每組6只，即空白對照組、60Co-γ射線最佳輻照劑量樺褐孔菌多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組、未輻照樺褐孔菌多糖高劑量組。三種劑量分別為50、250、500 mg/kg·BW，空白對照組灌胃生理鹽水，小鼠灌胃劑量0.1 mL/10 g，實驗劑量的確定參考其他研究中的劑量[25]。每天記錄體重、糧重、水重，持續(xù)灌胃30 d。

1.2.5 小鼠試驗前后體重、體重增加量與進(jìn)食量測定 根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[26]的要求每天記錄小鼠的體重、糧重、水重，喂養(yǎng)30 d后根據(jù)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.6 小鼠爬桿時間與力竭游泳時間測定 第30 d灌胃1 h后，進(jìn)行爬桿實驗。準(zhǔn)備有機棒，將爬桿架放入水深30 cm，水溫（26±2）℃水箱中進(jìn)行實驗，使小鼠肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄從實驗開始到小鼠無力支撐從有機棒上掉落的時間[27]。按以上實驗方法，第3次跌落時終止實驗，累計3次的總時間作為爬桿時間，實驗結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)。測定完爬桿時間后，休息1 d，將小鼠放入水深約30 cm、水溫（26±2） ℃水箱中進(jìn)行游泳實驗，使小鼠一直處于肌肉緊張狀態(tài)。小鼠力竭的時間判斷為頭部沉入水中10 s內(nèi)不返回水面，記錄時間[28-29]，實驗重復(fù)三次。

1.2.7 小鼠肝糖原、肌糖原、全血乳酸含量與乳酸脫氫酶活性的測定 小鼠游泳結(jié)束后休息30 min，內(nèi)眥取靜脈血。脫頸處死后解剖取出小鼠肝臟，除去結(jié)締組織。實驗操作方法根據(jù)試劑盒方法，進(jìn)行測定肝糖原儲備量、肌糖原含量，測定全血乳酸含量[30]，測定血清中乳酸脫氫酶活性[31]。

1.2.8 小鼠血清尿素氮含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測定 取游泳力竭后的立即處死的小鼠骨骼肌細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明要求制備成骨骼肌細(xì)胞勻漿。檢測血清尿素氮含量與骨骼肌中 SOD活力、MDA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗使用SPSS 23.0對整理后的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算各組均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行顯著性差異分析。所得的數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD）的形式表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P＞0.05表示無顯著性差異即無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌多糖最佳輻照劑量的選定

經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3299x+0.1833（R2=0.986），多糖含量如下表所示，由表1得出，樺褐孔菌經(jīng)60Co-γ輻照后，隨著輻照劑量的增大，多糖含量增加，且20 kGy處理增加最顯著（P＜0.05），可能是因為產(chǎn)物中含有酸性物質(zhì)或含有羧基基團的物質(zhì)，龔志華[32]通過對茯苓不同輻照劑量處理多糖相對分子量和組分分析表明，茯苓輻照后，水溶性總糖的數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）、重均相對分子質(zhì)量（Mw）以及多分散系數(shù)（PI）均不同程度地增大；同時，茯苓輻照降解產(chǎn)物的多糖組成分析結(jié)果顯示：茯苓經(jīng)1000 kGy輻照劑量處理后，降解產(chǎn)物主要是以酸性多糖為主。輻照劑量過高可能導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致多糖含量下降。當(dāng)輻照劑量為20 kGy時，樺褐孔菌菌粉中提取出的多糖含量最高，故本實驗選取輻照劑量為20 kGy的樺褐孔菌用于后續(xù)的動物實驗。

表1 不同輻照劑量處理后的多糖含量Table 1 Polysaccharide content after treatment with different irradiation doses

2.2 樺褐孔菌多糖對小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

2.2.1 小鼠實驗前后體重、增加量與進(jìn)食量結(jié)果由表2結(jié)果可知，30 d灌胃藥品并未對小鼠體重有明顯影響，且未出現(xiàn)任何異常，各劑量組間動物體重增加量基本一致。其他四組攝食量比空白對照組高，灌胃組進(jìn)水量相比于空白組較高，且在每天換一次墊料的條件下，與對照組相比，其他組墊料較濕潤，小鼠毛發(fā)柔順具有光澤，較活潑，且精力旺盛。結(jié)果表明，經(jīng)灌胃后小鼠攝食量、進(jìn)水量增加，且毛色更加有光澤。

表2 實驗前后小鼠指標(biāo)結(jié)果Table 2 Mouse index results before and after the test

2.2.2 力竭游泳與爬桿時間研究結(jié)果 運動時間的長短，直接反映了藥物的效果，即抗疲勞效果。給藥組隨著給藥劑量的增加，爬桿時間與力竭游泳時間均有不同程度的增加。

結(jié)果如表3所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組小鼠力竭游泳和爬桿時間均有顯著差異（P＜0.05），CK與輻照低劑量組無顯著差異（P＞0.05）。由此說明，經(jīng)樺褐孔菌多糖干預(yù)后小鼠游泳與爬桿運動時間均得到提高，其中，未輻照組與輻照高劑量組效果有顯著差異（P＜0.05）。曹利丹[33]通過小鼠負(fù)重游泳實驗結(jié)果得出樺褐孔菌多糖能夠顯著延長小鼠游泳時間。輻照高劑量組顯著增加了小鼠游泳和爬桿時間，因此，輻照樺褐孔菌多糖比未輻照樺褐孔菌多糖能更明顯地延長小鼠游泳與爬桿時間，且在500 mg / kg·BW（輻照高劑量）灌胃劑量下有效增加小鼠運動的時間。

表3 小鼠力竭游泳與爬桿時間結(jié)果Table 3 Mice exhausted swimming and pole climbing time results

2.2.3 小鼠肝糖原、肌糖原含量檢測結(jié)果 糖原是人體儲備能量的一種形式，在體內(nèi)葡萄糖降低的時候能夠分解為葡萄糖供能，同時脂肪及蛋白質(zhì)在葡萄糖降低的時候也會通過糖異生的途徑轉(zhuǎn)化為肝糖原從而提供能量。肌糖原的主要作用也是為機體提供能量。運動時體力衰竭是運動促進(jìn)了糖原的消耗，為了維持糖原的水平，導(dǎo)致機體中糖原分解速度的加快[34]。

由表4可知，與CK比較，經(jīng)樺褐孔菌多糖干預(yù)后的肌糖原含量均顯著升高（P＜0.05），CK與低劑量組對肝糖原含量無顯著差異（P＞0.05），這可能是由于輻照低劑量組灌胃劑量少，對肝糖原含量影響較小。高劑量組中肝糖原、肌糖原含量最高，且相同濃度作用下，未輻照組肝糖原、肌糖原含量顯著低于輻照組（P＜0.05）。黃鈴[35]通過小鼠灌胃樺褐孔菌多糖測定肝糖原含量得出，多糖各劑量組小鼠的肝糖原含量均高于對照組，證實了此實驗對抗疲勞效果的有效性，因此輻照樺褐孔菌多糖有能明顯增加小鼠肝糖原、肌糖原儲備量的作用。

表4 各組小鼠肝糖原、肌糖原含量Table 4 Contents of liver glycogen and muscle glycogen in each group of mice

2.2.4 小鼠全血中乳酸含量檢測結(jié)果 一般運動時機體會進(jìn)行無氧呼吸，產(chǎn)生大量乳酸，造成缺氧，使得體內(nèi)乳酸堆積，所以一般運動后會出現(xiàn)身體酸痛的情況，造成疲勞現(xiàn)象，所以產(chǎn)生乳酸的濃度與疲勞產(chǎn)生程度有很大的關(guān)系，且呈正比。

如表5所示，與CK相比，其他組乳酸含量均有所下降，且呈劑量依賴性。輻照樺褐孔菌多糖的低、中、高劑量組與未輻照組小鼠BLA含量均有顯著差異（P＜0.05），未輻照高劑量組與輻照高劑量組差異不顯著（P＞0.05）。ZHONG等[36]通過小鼠游泳實驗，證明了樺褐孔菌多糖能夠增加肝糖原含量，降低全血乳酸含量。從而可知，乳酸的產(chǎn)生會使機體產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，輻照樺褐孔菌多糖能夠降低小鼠乳酸含量，緩解運動中無氧呼吸造成的乳酸堆積現(xiàn)象。

表5 各組小鼠BLA含量Table 5 BLA content of mice in each group

2.2.5 小鼠血清中乳酸脫氫酶活性檢測結(jié)果 血清中的乳酸脫氫酶是一種體內(nèi)能量代謝過程中產(chǎn)生的酶，在內(nèi)臟等組織中廣泛存在。通過檢測乳酸脫氫酶的活性，可以有效為醫(yī)學(xué)病理學(xué)提供幫助，例如心腦血管病、動脈硬化及肝病等大多數(shù)疾病[37]。乳酸含量與清除乳酸的乳酸脫氫酶活性是評價機體疲勞和抗疲勞能力的重要指標(biāo)。

如表6所示，與CK相比，其他組都增加了乳酸脫氫酶活性，輻照樺褐孔菌多糖的低、中、高劑量組與未輻照組小鼠LDH活性均有顯著差異（P＜0.05），未輻照組LDH活性顯著低于輻照組（P＜0.05），且輻照組呈濃度依賴性。乳酸脫氫酶能夠加速乳酸的代謝，維持機體乳酸平衡，從而減少機體中乳酸產(chǎn)生，減輕疲勞癥狀。此實驗證實輻照高劑量組對增強小鼠運動時LDH活性有顯著效果。

表6 各組小鼠血清中LDH活性Table 6 LDH activity in mouse serum of each group

2.2.6 小鼠血清尿素氮含量檢測結(jié)果 正常情況下，機體尿素的生成與排泄處于平衡狀態(tài)，機體經(jīng)過長時間運動時不能獲得代謝所得的足夠能量，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、氨基酸的分解代謝水平上升，進(jìn)而使血液中尿素氮含量有所上升[38]。機體的抗疲勞能力在一定程度上體現(xiàn)為減少機體中血清尿素氮含量。

如表7所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組血清尿素氮含量均有顯著差異（P＜0.05），隨著灌胃劑量的增加，血清尿素氮含量相應(yīng)減少。CK組經(jīng)過長時間運動后血清尿素氮含量迅速上升，輻照高劑量組能夠顯著降低血清尿素氮含量，且顯著低于未輻照高劑量組（P＜0.05）。實驗證明經(jīng)過輻照樺褐孔菌多糖干預(yù)能夠有效降低血清尿素氮含量，緩解疲勞癥狀。

表7 各組小鼠血清尿素氮含量Table 7 Urea nitrogen content in mouse serum of each group

2.2.7 小鼠SOD活力、MDA含量檢測結(jié)果 機體運動時自由基增多，會導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能下降，產(chǎn)生疲勞，自由基與多不飽和脂肪酸反應(yīng)形成過氧化脂質(zhì)，代謝生成丙二醛（MDA）[39]。SOD是體內(nèi)清除超氧陰離子自由基最重要的酶。

如表8所示，與CK相比，輻照樺褐孔菌多糖的中、高劑量組與未輻照組小鼠骨骼肌細(xì)胞中SOD活力、MDA含量均有顯著差異（P＜0.05），經(jīng)過力竭測試后，小鼠骨骼肌中MDA含量上升，輻照高劑量組能夠顯著降低骨骼肌中MDA含量（P＜0.05），且顯著低于未輻照組；輻照高劑量組能夠顯著增加骨骼肌中SOD活性（P＜0.05），且顯著高于未輻照組，說明輻照樺褐孔菌多糖具有清除自由基的作用，從而減少代謝生成MDA，對自由基造成的機體損害具有保護(hù)作用。

表8 各組小鼠SOD活力、MDA含量Table 8 SOD activity and MDA content in mouse of each group

3 討論與結(jié)論

疲勞是一種疲憊和缺乏能量的亞健康狀態(tài)，已經(jīng)成為影響世界20 %以上人口的嚴(yán)重問題。疲勞常分為中樞疲勞和外周疲勞，外周疲勞是指由于過度訓(xùn)練而使肌肉功能下降從而導(dǎo)致的不良生理狀態(tài)[40]。據(jù)報道，組織糖原的消耗是外周疲勞的一個關(guān)鍵因素[41]。能量資源的持續(xù)供應(yīng)和代謝副產(chǎn)物的消除可以恢復(fù)外周疲勞[42]。此外，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡會被劇烈運動破壞，導(dǎo)致活性氧化物和丙二醛的過量產(chǎn)生。這些過氧化物也會導(dǎo)致身體疲勞[43]。

據(jù)報道，力竭性游泳運動會導(dǎo)致一些與疲勞有關(guān)的血液生化指標(biāo)的變化，如乳酸和尿素氮[44]，碳水化合物糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸的過度積累導(dǎo)致肌肉和血液pH下降，并抑制糖酵解相關(guān)酶的產(chǎn)生和ATP的合成，導(dǎo)致肌肉疲勞。肝臟和骨骼肌中的糖原水平可以反映疲勞程度，糖原的水平直接決定了身體的運動耐力[45]。

本研究討論了輻照樺褐孔菌多糖對于小鼠抗疲勞能力的影響，結(jié)果表明，在5、10、20、30 kGy輻照劑量中，經(jīng)過60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌菌粉，提取所獲得的多糖含量最多的為20 kGy下的輻照劑量。通過給小鼠灌胃輻照樺褐孔菌多糖，測定其對小鼠力竭游泳時間和相關(guān)抗疲勞的生化指標(biāo)的影響，實驗表明，輻照樺褐孔菌多糖不會對小鼠的生長及發(fā)育造成不良影響，且可有效延長小鼠力竭游泳時長與爬桿時間，提高體內(nèi)肝糖原和肌糖原的水平，增加LDH、SOD的活性，并有效延緩BLA、SUN及MDA的積累，且經(jīng)60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌多糖作用要優(yōu)于未輻照組，推測由于輻照后多糖含量增加，純度有所上升，營養(yǎng)物質(zhì)得到保留。孫熙浛等[46]探討了60Co-γ射線輻照處理對紅景天乙醇提取物抗氧化及美白作用的影響，得出20 kGy 的60Co-γ射線輻照處理紅景天乙醇提取物的抗氧化活性最強，并具有良好的美白功效，提示輻照處理能夠提高植物活性。ZHANG等[47]通過游泳測試等相關(guān)指標(biāo)測定發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖PIO-1不僅具有延緩身體疲勞的巨大潛力，而且改善精神疲勞。

綜上所述，經(jīng)60Co-γ射線輻照處理后的樺褐孔菌多糖具有比未輻照樺褐孔菌多糖更好的抗疲勞活性，說明其能夠在一定程度上緩解疲勞癥狀，發(fā)揮其營養(yǎng)價值與保健功效，這為輻照樺褐孔菌多糖在抗疲勞方面的開發(fā)與利用提供理論性參考。