微波法制備獼猴桃生物質(zhì)碳點(diǎn)及應(yīng)用于金銀花中Fe3+的檢測(cè)

趙鴻賓，冷天翠，劉曉夢(mèng)，姜艷萍，李春榮，孟鐵宏, ，胡先運(yùn),3,

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，貴州都勻 558000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房，貴州都勻 558000；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550002）

碳點(diǎn)（Carbon Dots，CDs）是以碳為骨架結(jié)構(gòu)的新型納米材料，是一種分散的粒徑小于10 nm的類球形納米顆粒[1]。CDs既具有優(yōu)良的熒光特性和水溶性，又具有生物相容性好[2]、化學(xué)穩(wěn)定性高[3]、耐光漂白性強(qiáng)[4]等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于光電[5]、安全與識(shí)別[6]、離子及藥物分子檢測(cè)[7-11]、熒光傳感[12]、細(xì)胞成像[13-14]等領(lǐng)域。

CDs的合成方法主要?dú)w納為“自上而下（Topdown）”和“自下而上（Bottom-up）”兩種方法[15]。自上而下法是通過氧化物切割碳而獲得如碳棒、碳纖維、碳納米管等材料。自下而上合成法則是具有-OH、-COOH、-C=O和-NH2等基團(tuán)的小分子、聚合物在高溫下脫水并進(jìn)一步碳化制備熒光碳點(diǎn)。自上而下的合成方法通常有電弧放電法[16]、激光燒蝕法[17]、電化學(xué)法[18]。自下而上的合成方法通常有：溶劑熱合成法[19]、燃燒法[20]、熱解法[21-22]和微波合成法[23]等。其中，微波法制備CDs的操作簡單，周期短，產(chǎn)率高，能耗低，是快速制備CDs的首選方法[24]。生物質(zhì)資源因具有來源豐富、分布廣泛、取材簡單、成本低廉、毒性小[25]等優(yōu)點(diǎn)，是制備CDs的理想碳源。利用生物質(zhì)制備的CDs熒光性能強(qiáng)，安全性高，易于功能化，因此生物質(zhì)CDs具有更廣闊的應(yīng)用空間[26-27]。目前，以果蔬為碳源合成CDs的研究已有諸多報(bào)道，楊克琴[28]以胡蘿卜為生物質(zhì)碳源，采用水熱法合成熒光生物質(zhì)碳點(diǎn)，并成功應(yīng)用于人膀胱癌活細(xì)胞熒光成像。穆海峰等[29]以紫甘藍(lán)為原料，硼氫化鈉為還原劑，采用水熱合成法制備了碳量子點(diǎn)。獼猴桃為常見水果，原料易得，果肉多汁，富含糖類、維生素、氨基酸等多種有機(jī)物，是合成CDs的優(yōu)質(zhì)碳源。

本文擬以獼猴桃為生物質(zhì)碳源，乙二胺為表面修飾劑，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化微波法制備氮摻雜CDs的參數(shù)。初步探討Fe3+對(duì)獼猴桃生物質(zhì)CDs熒光猝滅作用，嘗試建立一種測(cè)定金銀花等中藥材中鐵含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 購于都勻市水果超市，經(jīng)王傳明副教授鑒定為美味獼猴桃品種；金銀花 購于都勻市湘君大藥房；乙二胺、硫酸奎寧、醋酸、醋酸鈉及其它無機(jī)化學(xué)試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 為雙蒸水。

JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；icAN9型傅立葉紅外光譜儀 天津市能譜科技有限公司；F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；Cary 100型雙光束紫外可見光譜儀 北京安捷倫公司；S-2F型pH計(jì) 上海雷磁儀器公司；XT-9912型微波消解儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；P70F23PG5（S0）型微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CDs制備單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 乙二胺用量 將新鮮獼猴桃去皮榨汁，經(jīng)減壓過濾得獼猴桃汁約200 mL，置于2～6 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取一系?00 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁（含干物質(zhì)約0.13 g）和7.0 mL蒸餾水，再分別加入1、2、3、4、5、6 mL乙二胺，渦旋混勻后置于微波爐轉(zhuǎn)盤中，調(diào)節(jié)功率至560 W（中高火），加熱15 min。反應(yīng)后取出放冷，加入適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至一系列100 mL容量瓶中加水稀釋并定容。取適量溶液離心15 min（4000 r/min），取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。精密量取濾液1.0 mL稀釋定容至100 mL，靜置15 min，在365 nm激發(fā)光下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.1.2 加熱時(shí)間 取一系列100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁、1.0 mL乙二胺和7.0 mL蒸餾水，渦旋混勻后置于微波爐轉(zhuǎn)盤中，調(diào)節(jié)功率至560 W，逐一加熱，時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 min。反應(yīng)后取出放冷，并按1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行稀釋、離心、過濾等處理，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.1.3 加熱功率 取一系列100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁、1.0 mL乙二胺和7.0 mL蒸餾水，渦旋混勻后逐一放入微波爐轉(zhuǎn)盤中，分別調(diào)節(jié)功率為125 W（低火）、260 W（解凍）、400 W（中火）、560 W（中高火）、700 W（高火），加熱15 min。反應(yīng)后取出放冷，并按1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行稀釋、離心、過濾等處理，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.1.4 加水量 取5個(gè)100 mL錐形瓶，依次加入1.0 mL獼猴桃汁和1.0 mL乙二胺，再分別加入3、5、7、10、15 mL蒸餾水，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法加熱反應(yīng)，并進(jìn)行后續(xù)處理，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析，分別確定乙二胺用量、微波加熱時(shí)間、加熱功率、加水量等4個(gè)因素及其3個(gè)水平（如表1所示）。按照L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)完成CDs的制備，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并利用分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳制備條件制備獼猴桃碳點(diǎn)，加入適量蒸餾水溶解，稀釋成100 mL CDs儲(chǔ)備液。取20 mL CDs儲(chǔ)備液，離心15 min（4000 r/min），取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液透析12 h，減壓濃縮，干燥，得53.9 mg獼猴桃碳點(diǎn)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3 CDs結(jié)構(gòu)表征 將制備的CDs按要求進(jìn)行減壓干燥處理，采用JEM- 2100 透射電子顯微鏡觀察碳量子點(diǎn)形貌粒徑；采用icAN9傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定樣品的紅外光譜圖，分辨率為4 cm-1，波數(shù)400～4000 cm-1；采用F-7000熒光光譜儀測(cè)定熒光發(fā)射光譜；使用Cary100型雙光束紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定 將硫酸奎寧溶于濃度為0.1 mol/L的硫酸中，制得硫酸奎寧溶液（Φs=54.0%，365 nm），作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。在365 nm波長下，分別測(cè)定一定濃度的獼猴桃碳點(diǎn)溶液和硫酸奎寧溶液的紫外吸光度及熒光發(fā)射峰積分面積，并在室溫條件下測(cè)定其的折光率。根據(jù)公式（1）計(jì)算熒光量子產(chǎn)率[30]：

式中，Φ：熒光量子產(chǎn)率（%）；I：熒光發(fā)射峰積分面積（a.u.）；A：激發(fā)波長處溶液的吸光度；η：溶劑的折射率（%）；s：硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)物；x：獼猴桃生物質(zhì)碳點(diǎn)溶液。

1.2.5 Fe3+檢測(cè)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 放置時(shí)間 精密稱取1.2.2項(xiàng)下CDs適量，加蒸餾水配制成2.7 μg/mL的CDs溶液。取CDs溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入0.01 mol/L的FeCl3溶液1.0 mL，分別于5、10、15、20、30、45 min測(cè)其熒光強(qiáng)度，考察CDs與Fe3+放置時(shí)間。

1.2.5.2 緩沖溶液pH 取一系列10 mL容量瓶，依次加入1.2.4.1項(xiàng)下CDs溶液1.0 mL、0.01 mol/L的FeCl3溶液1.0 mL，再分別加入pH4.2、4.6、5.0、6.0的HAc-NaAc緩沖溶液1.0 mL，加去離子水稀釋至刻度，充分混合后靜置30 min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，比較在不同pH的HAc-NaAc緩沖溶液中，F(xiàn)e3+對(duì)CDs溶液熒光猝滅程度。

1.2.6 CDs應(yīng)用于Fe3+的檢測(cè) 依據(jù)1.2.4項(xiàng)下優(yōu)化條件，在一系列10 mL容量瓶中，加入1.2.4.1項(xiàng)下濃度為2.7 μg/mL的CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6）1.0 mL和不同體積的0.01 mol/L FeCl3溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度，考察Fe3+檢測(cè)的線性范圍。

另取一系列10 mL容量瓶，分別加入CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6）1.0 mL和0.01 mol/L不同離子的鹽溶液1.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，空白試驗(yàn)平行操作，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，考察該檢測(cè)方法的選擇性。

1.2.7 金銀花樣品的處理及其Fe3+的檢測(cè)

1.2.7.1 金銀花樣品前處理 精密稱取金銀花粉末0.1 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，先加入4 mL濃硝酸，放置30 min，再加入2 mL H2O2，加蓋放入微波消解儀中按表2程序消解。待消解完成將消解罐置于90 ℃電熱板上加熱，將酸趕盡，冷卻后收集于100 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，即得金銀花供試品溶液，置于2～5 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 微波消解程序Table 2 Program of microwave digestion

1.2.7.2 金銀花樣品中Fe3+的檢測(cè) 在10 mL容量瓶中，加入1.2.4.1項(xiàng)下同濃度的CDs溶液1.0 mL、HAc-NaAc緩沖溶液（pH4.6） 1.0 mL和1.0 mL金銀花供試品溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度（F/F0），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出金銀花供試品溶液中Fe3+的含量，并通過回收率試驗(yàn)考察該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

CDs制備單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及Fe3+檢測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018 軟件作圖，正交試驗(yàn)及離子選擇性數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDs制備單因素實(shí)驗(yàn)

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[31]，氮摻雜CDs常采用尿素、硫脲、乙二胺、乙二胺四乙酸等含氮化合物作為表面修飾劑，通過化學(xué)反應(yīng)，生成富含羧基和酰胺基等親水性官能團(tuán)的藍(lán)色或藍(lán)綠色熒光碳點(diǎn)。在CDs的合成中，首先考察了上述4種表面修飾劑對(duì)CDs合成的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以乙二胺為表面修飾劑合成的CDs熒光最強(qiáng)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以乙二胺為表面修飾劑合成碳點(diǎn)。當(dāng)乙二胺的加入體積為2 mL時(shí)，碳點(diǎn)的熒光較強(qiáng)，隨著體積的增大反而下降，究其原因可能是因?yàn)橐叶愤^量，在加熱時(shí)揮發(fā)導(dǎo)致反應(yīng)溶液溫度降低，從而影響CDs的合成。

加熱功率和時(shí)間均對(duì)CDs的合成有一定的影響。微波加熱的功率會(huì)直接影響反應(yīng)體系的溫度，當(dāng)功率為125 W，反應(yīng)15 min時(shí)，反應(yīng)混合物仍為液體。當(dāng)功率調(diào)為300 W以上時(shí)，反應(yīng)混合物為褐色固體，且在400 W時(shí)熒光最強(qiáng)。加熱時(shí)間在10 min以下時(shí)，由于維持高溫時(shí)間較短，合成CDs的熒光強(qiáng)度較低，當(dāng)加熱15 min時(shí)，合成CDs的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。同時(shí)，反應(yīng)混合液中水量增加也會(huì)影響反應(yīng)的溫度，當(dāng)微波加熱功率為560 W，加水5 mL時(shí)合成CDs的熒光最強(qiáng)，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)。

通過對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析，當(dāng)猴桃汁取樣量為1 mL時(shí)，各單因素中最佳水平分別為：乙二胺加入量2 mL，加水5 mL，微波加熱功率400 W，加熱時(shí)間15 min。詳見圖1（a～d）。

圖1 乙二胺用量（a）、加熱時(shí)間（b）、加熱功率（c）、加水量（d）對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effects of ethylenediamine dosage(a), heating time(b),heating power(c) and water content(d) on fluorescence intensity of CDs

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3）進(jìn)行方差分析，結(jié)果（見表4）表明：在制備獼猴桃碳點(diǎn)的條件中，微波加熱功率對(duì)CDs合成有極顯著性影響（P＜0.01），其他因素均無顯著性影響（P＞0.05），其影響程度大小依次為：C＞B＞A＞D，即微波加熱功率＞加熱時(shí)間＞乙二胺用量＞加水量，結(jié)合直觀分析，確定最佳的制備條件為：微波加熱功率560 W，加熱時(shí)間20 min，乙二胺用量2 mL，加水量5 mL。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

2.3 CDs結(jié)構(gòu)表征

為了解制備的CDs組成及表面基團(tuán)，對(duì)其進(jìn)行透射電子顯微鏡及紅外光譜表征，圖2 （a） 為CDs的TEM，從圖2 （a）中可以看出，制備的CDs呈形狀均一、大小均勻、在水中分散性良好，其平均粒徑約為2.5 nm。圖2 （b）為CDs的FT-IR，從圖2 （b）中可以看出，在3367 cm-1處的特征吸收峰為-OH或-NH-等活潑氫的伸縮振動(dòng)吸收峰，2833 cm-1處的特征吸收峰為-OCH3中的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，2946 cm-1處的特征吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1030 cm-1處的吸收峰為C-O伸縮振動(dòng)吸收峰。紅外光譜數(shù)據(jù)表明CDs的表面含有-OH、-NH-、C-O等基團(tuán)。

圖2 CDs 的TEM圖（a）和FT-IR光譜圖 （b）Fig.2 TEM image （a） and FT-IR spectrum （b） of CDs

CDs水溶液在日光下呈微黃色，在紫外燈照射下，發(fā)射藍(lán)色熒光。對(duì)CDs進(jìn)行紫外-可見吸收光譜及熒光光譜性能測(cè)試，紫外吸收?qǐng)D如圖3（a）所示，在約256～300 nm范圍內(nèi)有紫外吸收帶，該吸收帶主要是CDs sp2區(qū)域中π-π* 躍遷[32]。在365 nm波長紫外光的激發(fā)下，其發(fā)射峰波長為452 nm，半峰寬約為110 nm，溶液如圖3（b）所示。采用硫酸奎寧（其量子產(chǎn)率為54.0%）作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，為了使再吸收效應(yīng)最小化，所測(cè)溶液的吸光度值均應(yīng)小于0.05，測(cè)得CDs的熒光量子產(chǎn)率為5.6%。

圖3 CDs的紫外-可見吸收光譜圖（a）和熒光發(fā)射光譜圖（b）Fig.3 UV-vis absorption spectrum（a） , fluorescene emission spectrum （b）

2.4 Fe3+的檢測(cè)條件的優(yōu)化

如圖4所示，CDs水溶液在放置5～20 min時(shí)，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，20～45 min，熒光強(qiáng)度減弱趨緩。在pH4.2～5.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，CDs的熒光強(qiáng)度隨著pH的增大逐漸減弱，當(dāng)HAc-NaAc緩沖溶液pH4.6時(shí)，F(xiàn)e3+對(duì)CDs的熒光猝滅效果最佳。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[33]，為了排除溶液pH對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響，故選擇在pH4.6的HAc-NaAc緩沖溶液中考察Fe3+對(duì)CDs熒光強(qiáng)度的影響。

圖4 放置時(shí)間影響 （a）及pH影響 （b）Fig.4 Effect of storage time(a) and pH(b)

2.5 CDs應(yīng)用于Fe3+的檢測(cè)

為進(jìn)一步考察Fe3+對(duì)CDs熒光猝滅的動(dòng)力學(xué)特征，研究Fe3+溶液濃度的變化對(duì)CDs熒光猝滅的影響，如圖5（a）所示，隨著Fe3+濃度的增加，CDs熒光強(qiáng)度逐漸減弱。當(dāng)Fe3+的加入量在0.2～10 μmol/L范圍內(nèi)，CDs的熒光猝滅程度（F/F0）隨Fe3+濃度的增加而呈線性下降，如圖5（b）所示，其線性方程為Y=-0.05312c+1.01882（R2=0.9934），線性關(guān)系良好，檢出限（S/N=3）為0.12 μmol/L。

圖5 CDs隨Fe3+濃度（0～10 μmol/L）變化的熒光光譜圖（a）及CDs的熒光猝滅程度與Fe3+濃度（0.2～10 μmol/L）之間的關(guān)系曲線（b）Fig.5 Fluorescence spectra of CDs with Fe3+ (0～10 μmol/L)(a) and the curves of CDs fluorescence quenching with Fe3+(0.2～10 μmol/L)(b)

2.6 CDs對(duì)Fe3+的選擇性

為研究CDs應(yīng)用于Fe3+檢測(cè)的選擇性，在相同的濃度下，取Fe3+、Cr3+、Co2+、Ni2+、Sn2+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、K+、Al3+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Pb2+等16種常見金屬離子進(jìn)行試驗(yàn)，并進(jìn)行單因素方差分析。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均滿足方差齊性要求，單因素方差分析結(jié)果表明Fe3+組與空白組及其它離子組之間差異明顯，說明Fe3+對(duì)CDs 熒光猝滅作用明顯，CDs應(yīng)用于Fe3+的檢測(cè)有較好的選擇性。除Fe3+組以外的其他金屬離子與空白組之間無明顯差異，結(jié)果如圖6所示。

圖6 CDs 對(duì)金屬離子的選擇性Fig.6 Selectivity of ions as using CDs probes

2.7 金銀花樣品中的Fe3+的檢測(cè)

基于Fe3+對(duì)CDs熒光猝滅作用，試驗(yàn)采用熒光光度法[34]測(cè)定金銀花樣品中的Fe3+。為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度，試驗(yàn)選用常用中藥材金銀花為檢測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如表5。其加標(biāo)回收率在98.82%～103.20%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）介于1.67%～2.05%之間，符合中國藥典[35]方法學(xué)考察要求。表6為不同方法檢測(cè)金銀花中Fe3+的結(jié)果。其中，本文采用的熒光光度法檢出限較原子光譜法低，線性范圍也相對(duì)較小，這表明該方法適合微量Fe3+的檢測(cè)。

表5 金銀花Fe3+的檢測(cè)與加樣回收率（n=3）Table 5 Determination results and recovery of Fe3+ in honeysuckle (n=3)

表6 與其他檢測(cè)Fe3+的方法比較Table 6 Comparison with other methods for determination of Fe3+

3 結(jié)論

近年來，利用天然產(chǎn)物合成碳點(diǎn)，因其綠色環(huán)保、無毒無害，成為熒光探針研究的熱點(diǎn)。本文以獼猴桃為生物質(zhì)碳源，乙二胺為表面修飾劑，采用微波法一步合成了具有功能化的獼猴桃生物質(zhì)碳點(diǎn)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了制備工藝參數(shù)，其最佳參數(shù)為微波加熱功率560 W，加熱時(shí)間20 min，乙二胺用量2 mL，加水量5 mL。該參數(shù)穩(wěn)定可靠，較水熱法[39]合成CDs時(shí)間短，操作簡便。

基于CDs熒光強(qiáng)度隨加入Fe3+濃度的增大而呈線性減弱，進(jìn)而建立一種檢測(cè)鐵離子的方法。本文方法相對(duì)原子光譜法，檢測(cè)限低，線性關(guān)系良好，符合方法學(xué)考察要求，是一種具有選擇性好、檢測(cè)成本低、快速靈敏的Fe3+檢測(cè)方法，可用于中藥材中微量鐵的檢測(cè)。