白芍總苷通過miR-23b-3p/FoxA1對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

李玉磊 張瑞芳 劉莉敏

肺炎是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因，肺泡上皮細胞損害及炎癥細胞浸潤與肺炎的發(fā)展密切相關(guān)；研究表明，中醫(yī)藥能改善臨床癥狀，減輕炎癥反應，提高臨床療效[1-2]。白芍總苷是從中藥白芍干燥根部提取的有效成分，具有廣泛的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。研究報道白芍總苷可降低炎癥程度，對慢性心力衰竭大鼠起保護作用[4]。白芍總苷可以有效調(diào)節(jié)炎癥因子表達，減少結(jié)腸組織的炎癥損傷[5]。白芍總苷通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達，抑制氧化應激和炎癥級聯(lián)反應，進而抑制局灶性腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷[6]。肺炎鏈球菌是導致社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體，然而白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響及機制尚不清楚。研究報道重癥肺炎患兒外周血中miR-23b-3p低表達，與病情加重、炎癥反應激活有關(guān)[7]。miR-23b-3p靶向PALM3抑制肺炎鏈球菌誘導的A549炎癥和細胞凋亡[8]。在線軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p與叉頭盒蛋白A1(FoxA1)有結(jié)合位點。而抑制叉頭盒蛋白A1(FoxA1)表達可緩解脂多糖誘導的肺泡上皮細胞損傷[9]。然而miR-23b-3p與FoxA1的關(guān)系，以及白芍總苷是否調(diào)控miR-23b-3p與FoxA1的表達也尚不清楚。本實驗旨在研究白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響及機制是否與miR-23b-3p與FoxA1有關(guān)。

資料與方法

一、材料

肺泡上皮細胞A549、肺炎鏈球菌購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；白芍總苷膠囊(國藥準字H20055058，規(guī)格：0.3g/粒)購自寧波立華制藥有限公司；CCK-8試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒購自上海研生實業(yè)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司。

二、方法

1 細胞處理與分組 肺泡上皮細胞A549培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞，用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細胞，作為模型(Model)組，未經(jīng)感染的細胞作為對照(Con)組；分別用17.5 mg/mL、35 mg/mL、70 mg/mL的白芍總苷處理A549細胞后，用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌感染，作為Model+白芍總苷低、中、高劑量組；將miR-23b-3p抑制劑轉(zhuǎn)染A549細胞后，用70 mg/mL的白芍總苷處理，再用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌感染，作為Model+白芍總苷+anti-miR-23b-3p組。

2 CCK-8檢測細胞活性 各組培養(yǎng)48 h的細胞，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值(OD)。

3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用預冷的PBS漂洗，加入400 μL的結(jié)合緩沖液重懸細胞；然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、IL-10水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體按照試劑盒操作進，酶標儀檢測各組OD450nm值；以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線，根據(jù)樣品OD值在標準曲線上查找相應濃度。

5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-23b-3p表達水平 提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進行PCR擴增，95 ℃預變性2 min(1個循環(huán))，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(40個循環(huán))，72 ℃延長5 min；相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-23b-3p上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGGAT-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTGGTAAT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6 蛋白質(zhì)印跡法檢測FoxA1蛋白表達 提取總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉1 h，加入FoxA1抗體(1 ∶800)4 ℃孵育過夜；加入二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平。

7 雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建FoxA1的3′UTR野生型和突變型熒光素酶載體，將其分別與miR-NC或miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染至A549細胞，按照試劑盒說明書操作檢測細胞的熒光素酶活性。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和細胞活性的影響

與Con組相比，Model組A549細胞活性降低，細胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)；與Model組相比，Model+白芍總苷低、中、高劑量組A549細胞活性升高，細胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1)。

圖1 白芍總苷抑制肺炎鏈球菌誘導A549細胞凋亡、提高細胞活性及對IL-6和IL-10含量的影響

二、白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中miR-23b-3p和FoxA1表達的影響

與Con組相比，Model組肺泡上皮細胞中miR-23b-3p表達水平降低，F(xiàn)oxA1蛋白表達水平升高(P<0.05)；與Model組相比，Model+白芍總苷低、中、高劑量組肺泡上皮細胞中miR-23b-3p表達水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達水平降低，呈劑量依賴性(P<0.05)(圖2)。

圖2 白芍總苷對miR-23b-3p和FoxA1表達的影響

三、過表達miR-23b-3p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡、細胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

與Model組和Model+miR-NC組相比，Model+miR-23b-3p組miR-23b-3p表達水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達水平降低，細胞活性升高，細胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 過表達miR-23b-3p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡、細胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

四、抑制miR-23b-3p對白芍總苷作用的肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡、細胞活性及IL-6和IL-10含量的影響

與Model+白芍總苷組相比，Model+白芍總苷+anti-miR-23b-3p組miR-23b-3p表達水平降低，F(xiàn)oxA1蛋白表達水平升高，細胞活性降低，細胞凋亡率升高，IL-6含量升高，IL-10含量降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 抑制miR-23b-3p可逆轉(zhuǎn)白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導A549細胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影響

五、miR-23b-3p靶向FoxA1

Targetscan軟件預測顯示FoxA1的3′UTR含有miR-23b-3p的互補序列(圖5)；wt-FoxA1與miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而mut-FoxA1與miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性無顯著變化。

圖5 FoxA1和miR-23b-3p的互補序列及熒光素酶活性檢測

討 論

近些年研究表明，中醫(yī)藥治療肺炎具有一定的優(yōu)勢和特色，因此開發(fā)新的中藥對治療肺炎具有重要意義[10]。研究報道白芍總苷能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應而對動脈粥樣硬化表現(xiàn)出一定的保護作用[11]。白芍總苷抑制XIST表達以調(diào)節(jié)miR-124-3p/ITGB1軸，從而減輕缺氧/復氧處理的腎細胞的凋亡和炎癥[12]。白芍總苷通過降低炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平以及減少細胞凋亡來減輕大鼠的血腦屏障破壞和腦缺血/再灌注損傷[13]。本實驗用肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞建立肺炎細胞模型，用不同濃度的白芍總苷處理，結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞的活性升高，細胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高，呈劑量依賴性；IL-6是促炎細胞因子，IL-10是抑炎細胞因子，因此，本實驗結(jié)果表明，白芍總苷可濃度依賴性的抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應。

研究報道硫酸鈹誘導的人支氣管上皮細胞16HBE中miR-23b-5p表達下調(diào)[14]。miR-23b-3p調(diào)控脂蛋白(a)抑制同型半胱氨酸誘導的冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞損傷[15]。本實驗結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中miR-23b-5p表達水平降低，過表達miR-23b-3p后，細胞活性升高，細胞凋亡率降低，IL-6含量降低，IL-10含量升高；表明過表達miR-23b-3p可抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應。而且本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p靶向調(diào)控FoxA1的表達。本研究報道脂多糖誘導的急性肺損傷過程中FoxA1上調(diào)表達[16]。抑制FOXA1表達能減輕LPS誘導的人肺泡上皮細胞HPAEpiC凋亡并促進其增殖[17]。沉默lncRNA H19通過調(diào)節(jié)miR-423-5p/FoxA1軸減輕肺損傷，炎癥和急性呼吸窘迫綜合征的纖維化[18]。本實驗結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中FoxA1蛋白表達水平升高。而過表達miR-23b-3p可降低FoxA1的表達。因此，表明miR-23b-3p可能通過調(diào)控FoxA1影響肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應。本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，白芍總苷處理后，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中miR-23b-3p表達水平升高，F(xiàn)oxA1蛋白表達水平降低。而抑制miR-23b-3p可逆轉(zhuǎn)白芍總苷對肺炎鏈球菌誘導A549細胞凋亡、活性和IL-6和IL-10含量的影響。

綜上所述，白芍總苷通過調(diào)控miR-23b-3p/FoxA1軸抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥。