春季亞低溫脅迫對油茶‘華碩’葉片光合生理特性的影響

高璐鑫 王 琪 陳雨晴 孫永江 張凌云

（北京林業(yè)大學林學院，森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

油茶（Camellia oleifera）是我國特有的木本食用油料樹種，茶油中不飽和脂肪酸的含量超過90%，具有極高的營養(yǎng)價值及保健價值[1]。我國油茶主要分布在亞熱帶地區(qū)，屬于冷敏感植物，然而受全球氣候異常的影響，油茶主要種植區(qū)的北緣常會受到低溫的侵襲。春季溫度迅速回升，促使油茶進入生長季（春梢萌動期），如果此時遇到突發(fā)性倒春寒（白天7～10 ℃，夜間3～5 ℃）天氣，將會導致油茶發(fā)生不同程度的亞低溫傷害，尤其是春梢抽長對于積溫的要求較高，達不到會直接影響當年的花芽分化以及嫁接扦插材料的質(zhì)量，進而對當?shù)赜筒璁a(chǎn)業(yè)發(fā)展造成影響[2-3]。

植物光合作用作為地球上最基本的能量轉(zhuǎn)化過程，對環(huán)境條件非常敏感，往往可以用來反映植物對不利環(huán)境因子的適應能力[4]。油茶具有“花果同期”現(xiàn)象，維持逆境脅迫下光合作用活性，對油茶生長發(fā)育具有重要意義。葉片光合機構(gòu)是低溫脅迫的首要傷害位點，低溫脅迫會破壞類囊體膜的完整性，抑制光合電子傳遞活性。植物光合電子傳遞鏈由光系統(tǒng)I（PS Ⅰ）和光系統(tǒng)II（PS Ⅱ）等組成，與PS Ⅱ相比，PS Ⅰ對低溫脅迫更加敏感，低溫脅迫下電子由于無法正常傳遞至氧化型輔酶II（NADP+），會更多的泄露給氧氣生成活性氧（ROS）[5]，大量的ROS 一方面抑制D1蛋白的修復導致PS Ⅱ光抑制[6]；另一方面會破壞PS Ⅰ[7]，而一旦PS Ⅰ發(fā)生光抑制后，由于恢復較慢，往往導致PS Ⅰ光抑制成為低溫脅迫下植物生長的主要限制因素，對植物的影響會更大[8]。低溫引起光合速率降低的原因，除了加劇光系統(tǒng)活性的傷害之外，還會通過抑制碳固定過程所需的酶活性，加劇光抑制程度[7]。近期，吳玲利等[9]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫（6 ℃）影響了油茶‘華碩’和‘華鑫’開花結(jié)實及葉片光合活性。雖然目前對低溫脅迫下植物葉片光能的吸收、傳遞和利用效率等已有相關研究，但亞低溫脅迫下油茶光葉片抑制機制仍未知。

葉片葉綠素熒光分析技術具有便捷、迅速和非破壞性等優(yōu)點，可了解葉片光合作用過程中能量的捕獲、傳遞、分配等方面的情況，具有反應“內(nèi)在性”的特點[10]。本研究以2 年生優(yōu)質(zhì)大果油茶品種‘華碩’盆栽苗為試材，通過測定亞低溫10 ℃/5 ℃（晝/夜）脅迫過程中油茶葉片快速葉綠素熒光誘導曲線和830 nm 光吸收曲線，結(jié)合葉片光合同化物含量的測定，分析油茶葉片葉綠素含量、光系統(tǒng)光化學活性、同化物積累量的變化，探究亞低溫脅迫下油茶葉片的光合適應機制，以期為油茶抗寒栽培管理技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗試材為2 年生油茶‘華碩’嫁接苗，2019年4 月種植于北京林業(yè)大學八家苗圃溫室（北緯40°00′48.59″，東經(jīng)116°20′43.08″），溫室日均光量子通量密度（PFD）值約500 μmol/(m·s)，晝/夜溫度均值約為28 ℃/20 ℃，塑料盆規(guī)格為內(nèi)徑 30 cm，高40 cm，每盆土和基質(zhì)的體積比例為1∶1，用硫磺粉調(diào)節(jié)pH 值為5.0～5.5。

1.2 試驗設置

于2019 年7 月選取生長一致的油茶，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d、進行均一化處理后，開始進行亞低溫脅迫11 d（PFD 400 μmol/(m·s)，晝/夜溫度10 ℃/5 ℃）。以在較適宜光溫條件（人工氣候室內(nèi)調(diào)節(jié)PFD 400 μmol/(m·s)，晝/夜溫度28 ℃/20 ℃）下生長的植株作為對照（CK）。脅迫后間隔1～2 d 進行葉綠素熒光參數(shù)的測定，于18：00—20：00 取每株油茶春梢中上部從上往下數(shù)第4 片完整健康、顏色基本一致的功能葉，保持葉片自然生長角度。在第2、6、11 天取相同部位的葉，清洗干凈并吸干水分，存入超低溫冰箱，進行各項生理指標測定。在亞低溫第11 天時，取功能葉，進行葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)觀察，重復3 次。

1.3 指標測定方法

1.3.1 葉綠素熒光參數(shù)測定

采用Dual-PAM100 熒光儀（Walz，德國）進行飽和脈沖分析，葉片測定前對葉片進行30 min的暗適應，測定PS Ⅰ反應中心色素（P700）中最大光氧化量子產(chǎn)量（Pm）[11]。用Handy PEA 連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Hansatech，英國）測定葉片1s 內(nèi)的（JIP 時間）葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P 曲線）[12]，從O-J-I-P曲線上可直接獲得如下參數(shù),FO∶O 點為最小熒光；Fk∶k 點的熒光；Fj∶j 點的熒光；Fi∶i 點（30 ms）的熒光；Fm∶最大熒光，P 點的熒光。按公式（1）～（9）計算PS Ⅱ最大光化學效（Fv/Fm）、k 點相對可變熒光（Vk）、J 點相對可變熒光（Vj）、O-JI-P 熒光誘導曲線的初始斜率（Mo）、單位面積有活性反應中心數(shù)目（RC/CSm）、捕獲的激子將電子傳遞到QA以后的其他電子受體的概率（ψEo）、單位面積吸收的光能（ABS/CSm）、t時刻的相對可變熒光大?。╒t）、相對可變熒光差異（ΔVt）。

1.3.2 葉片生理指標的測定及超微結(jié)構(gòu)的觀察

丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸顯色法；葉綠素含量采用乙醇丙酮提取法，可溶性糖及淀粉含量采用苯酚法，相對電導率采用電導率儀法[13]。

分別選取對照和亞低溫脅迫第11 天的葉片小葉脈切取大小2 mm×2 mm 小塊，3.5% 戊二醛固定，0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗3 次，1%鋨酸室溫固定5 h，梯度酒精脫水，Epon 812環(huán)氧樹脂浸透包埋，Leica UC7（Leica，德國）超薄切片機切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，HT7700 透射電子顯微鏡（HITACHI，日本）下觀察，采集圖像分析，每個樣品取15 個視野觀察統(tǒng)計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)分析，SigmaPlot 10 進行圖表繪制。所有數(shù)值均為8 次重復的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞低溫脅迫對油茶葉片葉綠素含量的影響

由表1 可知，與CK 相比，隨著亞低溫脅迫時間的延長，油茶葉片葉綠素含量呈降低趨勢。其中葉綠素a 含量在處理2 d 后降低了10%，到6 d 和11 d 后含量降低顯著（P＜0.05），分別下降了23%和28%；類胡蘿卜素在亞低溫處理不同時期均發(fā)生顯著降低（P＜0.05），與CK 相比，分別降低了14%、33%和57%；葉綠素b 和總?cè)~綠素含量變化趨勢與葉綠素a 基本一致。

表1 亞低溫脅迫對油茶葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉黃素及葉綠素總量的影響Table 1 Effects of sub-chilling stress on the contents of chlorophyll a(Chla), chlorophyll b(Chlb), carotenoid(Car) and total chlorophyll [Chl (a+b)] in C. oleifera leaves

2.2 亞低溫脅迫對油茶葉片O-J-I-P 曲線的影響

由圖1 可知，亞低溫脅迫處理不同時間后油茶葉片O-J-I-P 曲線發(fā)生明顯變化。從O-J-I-P 原始曲線的變化可以觀察到，亞低溫脅迫下油茶葉片O-J-I-P 曲線的形狀不同于CK，隨著亞低溫脅迫時間的延長，葉片的熒光曲線變化幅度增加，F(xiàn)m值降低幅度增加（圖1a），說明亞低溫脅迫抑制了葉片單位面積吸收的光能；對原始O-J-I-P 熒光曲線進行標準化后得到相對可變熒光差異變化曲線（圖1b），發(fā)現(xiàn)亞低溫脅迫導致油茶葉片O-J-I-P 曲線K點（300 μs）與j 點（2 ms）的相對熒光強度（Vk和Vj）升高，表明油茶葉片PS Ⅱ電子傳遞鏈活性受到了影響。

圖1 亞低溫脅迫對油茶葉片熒光強度的影響Fig. 1 Effects of sub-chilling stress on the chlorophyll fluorescence transients in C. oleifera leaves

2.3 亞低溫脅迫對油茶葉片光系統(tǒng)活性的影響

由圖2 可知，與CK 相比，亞低溫脅迫1 d 后葉片F(xiàn)v/Fm及Pm均發(fā)生明顯降低，分別降低7%和13%；處理5 d 后，二者均維持在穩(wěn)定的水平，表明亞低溫脅迫短期可引起油茶葉片發(fā)生較嚴重的光抑制，油茶葉片可能存在調(diào)控機制以應對長時間的亞低溫脅迫。

圖2 亞低溫脅迫對油茶葉片PS Ⅱ最大光化學效率Fv/Fm 及P700 最大氧化值Pm 活性的影響Fig. 2 Effect of sub-chilling stress on the maximum photochemical efficiency Fv/Fm(A) and P700 maximum oxidation value Pm(B) in C. oleifera leaves

隨著亞低溫脅迫時間的延長，至第5 天，Vk發(fā)生顯著升高，維持在一定范圍（圖3a）。RC/CSm可以反映PS Ⅱ單位面積有活性的反應中心的比例，ψEo表示PS Ⅱ捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中 QA-下游的其他電子受體的概率，PIabs表示植物葉片光合綜合性能指數(shù)。由圖3b、c、d可知，亞低溫脅迫導致了RC/CSm、ψEo及PIabs的降低，而5 天后，各參數(shù)基本維持不變，表明一定時間的亞低溫脅迫導致油茶葉片PS Ⅱ電子傳遞鏈受到抑制，從而進一步導致光合性能的降低。

圖3 亞低溫脅迫對油茶葉片PS Ⅱ的Vk、RC/CSm、ΨEo 及PIabs 的影響Fig. 3 Effect of sub-chilling stress on PS Ⅱ donor-side Vk(A), active reaction center numbers RC/CSm(B), acceptor-side ΨEo(C), and photosynthetic performance parameters PIabs(D) in C. oleifera leaves

2.4 亞低溫脅迫對油茶葉片細胞膜透性及碳同化產(chǎn)物積累的影響

由圖4 可知，隨著亞低溫脅迫時間的延長，相對電導率及MDA 含量均呈現(xiàn)增加的趨勢。處理前2 d，二者含量均與CK 無顯著差異；處理6 d，相對電導率及MDA 含量分別增加了62%和40%，處理11 d 后二者含量進一步增加。研究結(jié)果表明，長時間的亞低溫脅迫能夠?qū)е掠筒枞~片細胞膜發(fā)生較嚴重的損傷。

圖4 亞低溫脅迫對油茶葉片的相對電導率及MDA 含量的影響Fig. 4 Effect of sub-chilling stress on the relative electrical conductivity(A) and malondialdehyde content(B) in C. oleifera leaves

由圖5a 可知，隨著亞低溫脅迫時間的延長，油茶葉片中可溶性糖含量呈現(xiàn)出增加的趨勢。與CK 相比，處理2 d 和6 d 后的可溶性糖含量分別增加了14% 和34%，處理11 d 時可溶性糖含量穩(wěn)步增長，與6 d 時的結(jié)果相比差異不顯著。由圖5b 可知，隨著亞低溫脅迫時間的延長，淀粉含量呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，與CK 相比，處理2、6、11 d 后淀粉含量分別降低了5%、25%、46%。

圖5 亞低溫脅迫對油茶葉片可溶性糖及淀粉含量的影響Fig. 5 Effect of sub-chilling stress on soluble sugar and starch content in C. oleifera leaves

2.5 亞低溫脅迫對油茶葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下正常生長的油茶葉片葉肉細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞質(zhì)均勻，中央液泡占據(jù)細胞內(nèi)大部分空間，葉綠體呈梭形，粒片層垛疊整齊有序且體內(nèi)有較豐富的淀粉粒分布，細胞核結(jié)構(gòu)完整（圖6a）。亞低溫脅迫（10 ℃/5 ℃）11 d 后，油茶葉肉細胞結(jié)構(gòu)能夠維持完整，但淀粉粒的體積和數(shù)量明顯減少，呈圓球形或橢球型，細胞核核膜較清晰，但核質(zhì)均勻程度降低，液泡電子密度加深（圖6b）。研究結(jié)果表明，亞低溫脅迫下油茶葉肉細胞淀粉顆粒發(fā)生降解，可能通過轉(zhuǎn)化為可溶性糖轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)或其他組織中，從而抵御亞低溫對葉肉細胞造成的傷害。

圖6 亞低溫脅迫下油茶葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 6 Ultrastructure of mesophyll cells under sub-chilling stress

3 結(jié)論與討論

光合色素具有吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的功能，葉片中葉綠素含量與光合速率呈正相關，類胡蘿卜素可以起到光能捕獲和光破壞防御的作用[14]，而葉綠素缺乏會降低植物光保護能力[15]。本研究中，隨著亞低溫脅迫處理時間的延長，油茶葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均顯著低于CK，導致光合性能的降低；類胡蘿卜素含量顯著降低，表明亞低溫脅迫下油茶光破壞防御能力的降低，進一步導致光合機構(gòu)的損傷。

根據(jù)果實成熟期，一般將普通油茶分為‘寒露籽’、‘霜降籽’、‘立冬籽’3 個品種群?！A碩’通常在11 月初開花，立冬后達到盛花期[16]，花期越晚的品種各生長器官對光合同化物的競爭性越強。因此，冬春的低溫不僅影響‘華碩’授粉受精，還對其地理分布造成顯著影響[17]，推測這與低溫脅迫下光合作用的維持能力密切相關[18]。研究已表明，植物光下低溫脅迫會導致光合機構(gòu)吸收的光能超過光合作用所能利用的數(shù)量，引起光抑制的發(fā)生[19]。在黃瓜（Cucumis sativus）上的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會通過ROS 的累計導致黃瓜PS Ⅱ和PS Ⅰ活性均發(fā)生顯著抑制[20]，但也有研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫會導致多種熱帶樹葉片PS Ⅱ光抑制的發(fā)生，而PS Ⅰ活性未受到顯著影響[21]。本研究中，亞低溫處理1d 的油茶葉片F(xiàn)v/Fm及Pm均顯著降低，其中Pm下降時間早于Fv/Fm，表明葉片PS Ⅱ與PS Ⅰ活性均受到了抑制，與PS Ⅱ相比，PS Ⅰ對亞低溫更敏感，這可能與脅迫條件下PS Ⅰ處ROS 積累導致的氧化傷害有關[22]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫伴弱光（＜100 μmol/(m·s)）脅迫往往會加重植物PS Ⅰ光抑制，但適光條件（600 μmol/(m·s)）下，棉花葉片PS Ⅰ未表現(xiàn)出光抑制[23]，本研究僅探討了適光環(huán)境下，亞低溫對油茶光合機構(gòu)的影響，弱光是否會加劇油茶葉片PS Ⅰ光抑制，而強光是否通過加劇PS Ⅱ光抑制從而減緩亞低溫對PS Ⅰ的抑制程度，有必要進一步研究。

為全面了解亞低溫脅迫對整條光合電子傳遞鏈的影響，利用連續(xù)激發(fā)式熒光儀分析PS Ⅱ供體側(cè)、反應中心活性和受體側(cè)的變化。Vk能夠反映PS Ⅱ電子供體側(cè)放氧復合體（OEC）活性大小，Vk升高表示供體側(cè)受到傷害[24]。RC/CSm與ψEo可以作為反映脅迫對PS Ⅱ反應中心和電子受體側(cè)的抑制程度的指標[25]，PIabs可以反映光合電子傳遞鏈對光能的捕獲，能更準確的表征植物光合電子傳遞鏈的狀態(tài)[10]。本研究中，亞低溫脅迫后，油茶葉片Vk值升高，RC/CSm和ψEo下降，表明PS Ⅱ供體側(cè)、反應中心和受體側(cè)都受到傷害，且相對反應中心和供體側(cè)的活性下降而言，供體側(cè)的活性下降程度較輕；在亞低溫脅迫前期，PIabs顯著降低，表明亞低溫脅迫導致的油茶葉片光合機構(gòu)的光合性能降低與PS Ⅱ反應中心活性和受體側(cè)關系密切。因此在生產(chǎn)實際研究中，可以采用保護PS Ⅱ的反應中心活性和受體側(cè)的策略，進行低溫適應性篩選育種，防御亞低溫脅迫對油茶PS Ⅱ活性的抑制。

植物的膜系統(tǒng)是抵御外界不良脅迫條件和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關鍵結(jié)構(gòu)，膜透性的變化、及膜內(nèi)細胞液滲透壓等生理方面的變化大多都早于植株外部形態(tài)的變化，常被應用于抗逆性評價[23]。低溫脅迫往往會致使植物細胞膜脂過氧化，改變細胞膜透性，引起相對電導率的增加，對膜和細胞造成傷害[26]。MDA 是細胞膜膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量能反映膜受損程度和植物組織抗氧化的能力[27-28]。逆境脅迫下可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖等）的積累有利于維持細胞內(nèi)外正常的滲透壓，提高植物抗逆性[29-30]。本研究中，亞低溫脅迫下油茶葉片的相對電導率和丙二醛含量均顯著增加，表明亞低溫脅迫造成了油茶膜系統(tǒng)的損傷?？扇苄蕴堑暮侩S著亞低溫脅迫時間的延長呈增加的趨勢，而淀粉含量降低，表明油茶通過促進淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖，從而緩解亞低溫對油茶光合機構(gòu)的進一步傷害。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)亞低溫脅迫下，油茶葉片葉綠素含量、Fv/Fm及Pm均顯著降低，葉片光系統(tǒng)I 和II 的活性均受到抑制，導致光合機構(gòu)的光合電子傳遞鏈活性降低。葉片光合機構(gòu)電子傳遞鏈中PS Ⅱ電子供體側(cè)、有活性反應中心數(shù)量及電子受體側(cè)均發(fā)生不同程度的抑制?？扇苄蕴呛砍试黾于厔?，淀粉含量逐漸降低，一定時間內(nèi)，油茶葉片可以通過累積可溶性糖，維持亞低溫脅迫下光系統(tǒng)的活性。在生產(chǎn)實際中，可以采用保護PS Ⅱ的反應中心活性和受體側(cè)的策略，進行低溫適應性篩選育種，栽植耐寒性品種。油茶抵御亞低溫脅迫的過程復雜，是生理、基因等多層次的調(diào)控，研究油茶抗寒光合生理指標變化是選育抗寒新品種的基礎，目前油茶抗寒的代謝調(diào)控途徑尚不清楚，特別是同化物轉(zhuǎn)運機制還有待進一步研究。