氮添加對新疆野蘋果幼苗枝葉大小的影響

華兆暉， 陶 冶， 閆景明,3， 周曉兵， 張 靜， 張元明

（1.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；3.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護安徽省重點實驗室，安徽 安慶 246133)

新疆野蘋果（Malus sieversii）分布于中國、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦以及塔吉克斯坦的中亞天山山脈地區(qū)，是天山野果林的主要建群種之一［1］。新疆野蘋果具有原始的種質(zhì)資源，遺傳多樣性高，是全世界栽培蘋果的直系祖先［2］。伊犁河谷是極具代表性的新疆野蘋果分布地之一，由于西風(fēng)氣流、地勢以及逆溫層現(xiàn)象的影響而具有特殊的海洋性氣候，適宜落葉闊葉林生長，這也使得當(dāng)?shù)氐男陆疤O果具有最高的遺傳多樣性［3］。但目前由于人類活動、病蟲害以及氣候變化等多重因素［4］，新疆野蘋果林大面積退化，分布面積銳減，個體大量枯死，已經(jīng)造成了一些低頻度基因資源丟失［5］，且新疆野蘋果種群更新受阻，面臨瀕危與滅絕的危險。新疆野蘋果已被列為中國優(yōu)先保護物種名錄和國家二級重點保護植物［6］，對其進行種群保育與復(fù)壯意義重大。

當(dāng)年生小枝是植物最易受環(huán)境影響的構(gòu)件之一，也是反映植物與環(huán)境相互關(guān)系的性狀之一［7］。當(dāng)年生小枝主要由枝葉構(gòu)成，枝和葉是植物重要的營養(yǎng)器官，枝葉關(guān)系與植物的物質(zhì)能量配比相聯(lián)系，從而反映其對環(huán)境因子的響應(yīng)與生態(tài)適應(yīng)［8］。Corner［9］最早開始關(guān)注枝葉關(guān)系，提出了經(jīng)典的Corner法則，至今仍然有學(xué)者通過Corner法則檢驗來揭示植物對不同因子的響應(yīng)規(guī)律［10］。枝葉大小譜系在枝葉關(guān)系中占據(jù)重要地位，是植物生態(tài)變異的一個主導(dǎo)維度之一［11］。學(xué)者們通常用異速生長方程Y=βXα來表征枝葉大小關(guān)系，如Yan等［12］學(xué)者從枝葉生物量的角度運用異速生長關(guān)系揭示了擬南芥(Arabidopsis thaliana)對氮磷添加的響應(yīng)特征。李曼等［13］通過研究不同海拔梯度黃山松(Pinus hwangshanensis)枝葉大小異速生長關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了不同海拔高度的黃山松之間枝葉分配格局的差異，從而明確了黃山松在小枝水平上的適應(yīng)策略。

氮是生態(tài)系統(tǒng)中主要的限制因子之一，也是植物需求最高的營養(yǎng)元素。氮添加會對植物的氣孔結(jié)構(gòu)、氮含量、葉綠素含量、各種酶以及內(nèi)源激素等產(chǎn)生影響，從而對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響［14-15］。木本植物對氮添加的響應(yīng)常表現(xiàn)出種間差異性，如氮添加會促進紅砂(Reaumuria soongarica)幼苗葉片非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)的累積，而在大青(Clerodendrum cyrtophyllum)葉片中則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢［16-17］。在某些研究中適當(dāng)濃度的氮添加會促進植物的光合作用，而高濃度氮添加對植物的生長產(chǎn)生負效應(yīng)，而有些研究沒有產(chǎn)生高氮抑制現(xiàn)象［18-21］。

針對野蘋果退化現(xiàn)狀以及種群年齡結(jié)構(gòu)不均衡問題，有學(xué)者提出了人工栽種幼苗是其種群恢復(fù)的重要途徑［22］；養(yǎng)分添加則是提高幼苗存活率的關(guān)鍵點之一。但在野果林中，不同生境間土壤氮含量存在顯著差異［23］。這就加大了野蘋果保育與復(fù)壯的難度，因此迫切需要了解新疆野蘋果對氮添加響應(yīng)的理論基礎(chǔ)。以更好的實施針對性的保育措施。新疆野蘋果幼苗在不同氮添加條件下枝葉性狀與大小關(guān)系是否存在差異？枝葉之間異速生長關(guān)系有何變化規(guī)律？為此，本研究以新疆野蘋果一年生實生苗為研究對象，在試驗田中長期開展不同劑量的氮添加處理，測量并分析不同氮添加處理下新疆野蘋果當(dāng)年生小枝的枝葉功能性狀，揭示其在不同氮添加處理下的枝葉大小、相互關(guān)系以及響應(yīng)特征。研究結(jié)果可為新疆野蘋果的種群保育與復(fù)壯提供理論支撐。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地點位于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州新源縣野果林改良場（43°25′11″N，83°34′17″E），海拔約1000 m。年平均氣溫為7～9 ℃，平均最低氣溫為-7.4 ℃，年平均無霜期169 d，年日照時間為2500 h，年降水量為260～500 mm。

1.2 試驗設(shè)計與方法

樣地采用田間試驗，選擇種源一致的新疆野蘋果一年生實生苗為試驗對象。參考周邊果園的施氮量與施氮方式，共設(shè)定了4 個水平處理組，即CK(0 g·m-2·a-1)、N10(10 g·m-2·a-1)、N20(20 g·m-2·a-1)和N40(40 g·m-2·a-1)，其中CK 為對照處理組，N10為低氮處理組，N20 為中氮處理組，N40 為高氮處理組。每個處理組設(shè)有5 個重復(fù)樣方，每個樣方中有4 棵野蘋果幼苗，即每個處理組有20棵幼苗。采用完全隨機設(shè)計分布樣方，每個樣方長寬各1.5 m，各樣方間設(shè)有間隔為1 m 的隔離帶，防止樣方之間相互影響。在對角線方向上，距樣方四角0.3 m 定為植樹點，距離0.6 m處定為施肥點，將新疆野蘋果一年生實生苗栽種在各樣方的植樹點上，并進行1 次修枝處理，以保證幼苗存活。氮肥以尿素CH4N2O(含氮量為47%)形式添加，在施肥點將需要施加的氮肥量填埋進深約20 cm 的小坑中，并對施肥點進行澆水處理，利于幼苗深根系對養(yǎng)分的利用。2016年10月設(shè)置樣地，于2017 年4 月移載新疆野蘋果幼苗，之后每年春季與秋季進行2 次施氮處理，連續(xù)處理4 a，期間進行常規(guī)田間管理。

1.3 樣本采集與測量

2020年8月對新疆野蘋果幼樹的當(dāng)年生小枝樣品進行采集，統(tǒng)一選擇高度為1.5 m 的陽生小枝進行采集，采集時選擇主枝旁的側(cè)枝，用枝剪貼基部剪切。樣品采集后，裝入信封袋，立即放入帶冰的保溫箱中，帶回實驗室。

將小枝葉片取下，掃描葉片(EPSON Perfection V19)，并采用軟件(Adobe Photoshop CC 2018)測量出每小枝上總?cè)~面積(TLA)以及葉片數(shù)量(LN)。采用游標(biāo)卡尺測量小枝基徑(BD)，采用直尺測定小枝莖長(L)。最后，將枝葉放入烘箱內(nèi)70 ℃烘干至恒重，用分析天平(精度0.001 g)分別稱量莖干重(SM)和總?cè)~干重(TLM)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測量的新疆野蘋果小枝性狀指標(biāo)，計算單葉面積(LA)、單葉干重(SLM)、出葉強度(LI)、比葉面積(SLA)、葉面積比率(LAR)和葉莖質(zhì)量比(LAMR)。計算公式如下［24-25］：

式中：LA 為單葉面積；TLA 為總?cè)~面積；LN 為葉片數(shù)量；SLM為單葉干重；TLM 為總?cè)~干重；LI為出葉強度；SM為莖干重；SLA為比葉面積；LAR為葉面積比率；LAMR 為葉莖質(zhì)量比，其中LI、SLA、LAR 及LAMR屬于比值性狀。

采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析幼苗枝葉性狀間的差異性，各處理組之間采用LSD(Least Significant Difference)法進行多重比較。采用Pearson法分析新疆野蘋果各功能性狀的相關(guān)性，異速生長關(guān)系可以表示為：Y=βXα，式中：Y和X分別表示某一功能性狀；β是標(biāo)準(zhǔn)化常數(shù)；α是異速生長指數(shù)。在實際分析過程中對新疆野蘋果小枝性狀數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換：logY=logβ+αlogX，其中l(wèi)ogβ為截距。當(dāng)α=1 時表示等速生長關(guān)系，當(dāng)α≠1 時表示異速生長關(guān)系。之后進行異速生長方程的參數(shù)估計，參數(shù)估計方法采用標(biāo)準(zhǔn)化主軸估計法(SMA)。SMATR進行異速生長參數(shù)的估計與多重比較。

利用SPSS 23.0軟件進行描述統(tǒng)計分析、相關(guān)性分析及ANOVA 分析，采用Graphpad Prism 7 進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮處理對新疆野蘋果小枝性狀的影響

由圖1可知，從形態(tài)指標(biāo)來看，施氮對小枝莖的伸長有一定促進作用，且在中氮處理組中促進作用達到顯著性水平；相比于對照組，低氮、中氮和高氮處理組的小枝莖長分別增加了27.11%、43.35%和21.68%。不同處理之間其他形態(tài)與生物量指標(biāo)在統(tǒng)計學(xué)意義上均沒有顯著差異。從小枝莖層面來看，氮添加處理下對莖生物量積累有一定程度的促進作用，這種促進作用在小枝莖的增長增粗上均有體現(xiàn)；從小枝葉片層面來看，在氮添加處理下，TLM積累以及TLA均有增加趨勢，而SLM積累與SLA則均呈中氮處理減少，低、高氮處理增加的趨勢。

在各比值指標(biāo)中，LI在對照組與高氮處理組間表現(xiàn)出顯著性的下降，與對照組相比，出葉強度在低氮、中氮和高氮處理條件下分別降低了9.94%、3.34%和21.62%。LAR與LAMR隨著施氮強度的增加，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，中氮處理組與對照組和高氮處理組相比均顯著性降低；與對照組相比，LAR 在低氮、中氮和高氮處理條件下分別降低了10.47%、21.67%和3.25%，LAMR在低氮和中氮處理條件下，分別降低了8.08%和19.50%，在高氮處理條件下增加了1.76%。隨施氮劑量增加各比值指標(biāo)變化趨勢不同，SLA 與LI 呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但SLA 各組間差異不顯著，而LI 在N40 處理下與對照組相比顯著降低；LAR 與LAMR 呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，并且均在N20 處理下與對照組間存在顯著差異?？傮w上看，氮添加處理對新疆野蘋果的不同生長特性均產(chǎn)生了一定影響，比值指標(biāo)相較于形態(tài)以及生物量指標(biāo)對施氮更加敏感。

2.2 枝葉性狀間的相關(guān)性

由相關(guān)性分析（表1）可知，各性狀之間多具有緊密的相關(guān)性。枝性狀與葉性狀間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01），各枝性狀(L，BD，SM)之間也呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。除L 與SLA 無顯著相關(guān)外，其余枝性狀均與比值性狀(SLA，LI，LAR 及LMAR)呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），除LN、SLM 和LA 外，各葉性狀間也呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。葉片與各比值性狀之間的相關(guān)性要弱于枝條：除LN外，其余葉性狀均與SLM、LI呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），而在葉性狀中，LAR 僅與LN 呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），LAMR與LN 呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與SLM 和LA 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）?？傮w而言，枝葉性狀間具有緊密的相關(guān)性，枝條各性狀間的相關(guān)性要強于葉片各性狀間的相關(guān)性，枝葉性狀間均呈正相關(guān)，而比值性狀與枝葉各性狀間多呈負相關(guān)。

表1 不同氮處理下新疆野蘋果小枝性狀間的Pearson相關(guān)系數(shù)Tab.1 Pearson’s correlation coefficients among twig traits of Malus sieversii under different nitrogen fertilization

2.3 枝葉大小異速生長關(guān)系

將所有枝葉大小指標(biāo)進行異速生長方程的參數(shù)估計，共篩選到6 對枝葉大小指標(biāo)存在顯著的異速生長關(guān)系（表2，圖2）。其中有2對指標(biāo)的異速生長指數(shù)在不同氮處理組間存在顯著性差異，分別是L-TLA 和L-LN 性狀對，其余4 組則均具有共同的異速生長指數(shù)和不同的斜率（SM-TLM 除外）。除莖BD-LI的異速生長指數(shù)為負值外，其余5組的異速生長指數(shù)均為正值。

氮處理以及對照組的莖與總?cè)~片生物量之間（SM-TLM）呈現(xiàn)出共斜率（0.9221）、共截距（0.236）的等速生長關(guān)系，氮處理對枝葉生物量的異速生長關(guān)系沒有顯著影響（表2）。L-TLA性狀對中，N10處理（α=1.9479）和N20處理（α=2.0013）的異速生長指數(shù)相對于CK組（α=1.1623）顯著升高，而N40處理對該性狀對的異速生長指數(shù)沒有顯著性影響。在LLN 性狀對中，N40 處理（α=0.6858）的異速生長指數(shù)相對于CK組（α=1.0023）顯著性降低，異速生長指數(shù)總體上呈現(xiàn)出在低、中氮處理下增高，高氮處理下顯著降低的趨勢。在BD-LA性狀對中，各處理水平的異速生長指數(shù)間無顯著性差異（共同斜率為1.958），但相比于對照組（logβ=1.917），N10 處理（logβ=1.789）和N20處理（logβ=1.818）出現(xiàn)了顯著的截距漂移。

在BD-LI 性狀對中，各組間的異速生長指數(shù)沒有顯著差異（共同斜率為-2.062），截距之間的大小關(guān)系為：N10＞N20＞CK＞N40，存在顯著性的截距漂移（表2，圖2）。相對于對照，N10 處理和N20 處理的截距增加，在N10處理中達到顯著水平，而N40處理的截距則有一定程度的降低。在BD-SLM 性狀對中，其各處理下的異速生長指數(shù)無顯著差異且均顯著大于1（共同斜率為2.177），截距之間的大小關(guān)系為：N40＞CK＞N20＞N10，即存在顯著性的截距漂移；相對于對照組，N10處理和N20處理的截距降低，僅N10 處理達到顯著水平，N40 處理的截距不顯著增加。

圖2 雙對數(shù)坐標(biāo)下不同氮處理組新疆野蘋果枝葉大小性狀間的異速生長關(guān)系Fig.2 Log-log plots showing the allometric relationships between leaves size and stem size of Malus sieversii under different nitrogen fertilization

表2 不同氮處理下新疆野蘋果小枝性狀間的異速生長指數(shù)及等速生長檢驗Tab.2 Allometric scaling exponent and test of isometry among twig traits of Malus sieversii under different nitrogen fertilization

3 討論

當(dāng)年生小枝性狀可以在一定程度上反映出植物自身的生長狀態(tài)以及對環(huán)境變化的適應(yīng)［26］。在氮添加下，新疆野蘋果幼苗所有小枝性狀中僅枝長出現(xiàn)了顯著性的差異，說明枝長對于氮添加的響應(yīng)最敏感，且隨氮濃度增加呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，與彭鐘通等[27]在不同氮添加下辣木(Moringa oleifera)的三級枝長結(jié)果趨勢相符。植物的表型可塑性主要體現(xiàn)在不同器官的分配與權(quán)衡上，如枝葉生物量［28］。因此，新疆野蘋果對氮添加的響應(yīng)在比例指標(biāo)上表現(xiàn)得更加明顯。比葉面積(SLA)反映了植物葉片的資源獲取能力［29］，從研究結(jié)果來看，新疆野蘋果葉片的資源獲取能力較穩(wěn)定，受氮添加的影響不明顯。出葉強度表示單位莖干重上的葉片數(shù)量，反映的是植物的茂盛程度，高氮處理使新疆野蘋果的出葉強度顯著降低，這與異速生長分析中得出的新疆野蘋果通過減小出葉強度，增大對單葉的投入來響應(yīng)高氮處理這一結(jié)論相符。葉面積比率(LAR)和葉莖質(zhì)量比(LAMR)均反映植物對葉與莖的投入比例，相比于對照組，中氮處理組的LAR 與LAMR均顯著性降低，低氮處理組均呈現(xiàn)降低趨勢，這表明低、中氮處理組下的新疆野蘋果通過改變生物量積累來加大對莖的投入，而葉片的形態(tài)以及生物量對氮添加的響應(yīng)相對不敏感，但這不一定表明新疆野蘋果的葉片光合能力沒有改變；有研究表明，氮添加增強植物的光合能力多表現(xiàn)在生理層面，如葉片中葉綠素含量升高、與光合作用有關(guān)的酶活力增加等［15,19］。從整體上看，低中氮處理下的新疆野蘋果表現(xiàn)出偏向于對莖的投入，表明在低中氮處理下其枝葉的功能活性有所改善。

Yan 等［12］研究表明，氮添加處理對擬南芥的枝葉生物量格局產(chǎn)生了影響，而本研究的結(jié)果與之恰恰相反，不同氮水平下新疆野蘋果枝葉生物量的增速以及分配格局并未發(fā)生改變，且呈等速生長關(guān)系。這表明對于新疆野蘋果來說，氮添加對其枝葉之間的增速以及分配格局的影響并不體現(xiàn)在生物量上，而主要體現(xiàn)在枝葉形態(tài)上，如L-TLA和L-LN，這2對性狀對在氮添加處理下發(fā)生了顯著的增速改變。再如BD-LA 和BD-LI 性狀對，新疆野蘋果在氮添加處理下顯著改變了其分配比例。反映了擬南芥和新疆野蘋果對氮添加的響應(yīng)差異，可能是由于木本植物與草本植物的響應(yīng)策略不同造成的。木本植物枝葉生物量之間一般維持一個固定的增速，這在其他環(huán)境因子梯度上也較常見，如溫帶木本植物在海拔梯度上的枝葉生物量關(guān)系［30］。

光合作用是植物體生物量積累與代謝的重要過程，氮添加會對植物體產(chǎn)生諸多影響，如Aminolevulinic Acid(ALA)水平、葉綠素水平、N 含量等，最終都會在光合方面有所體現(xiàn)［31］。枝葉大小關(guān)系可反映植物在光合與機械支持、養(yǎng)分運輸?shù)确矫娴臋?quán)衡［8］。L-TLA 的異速生長結(jié)果表明：與對照組相比，在以同等速度增長枝長時，低、中氮處理下的新疆野蘋果幼苗有著更快的總?cè)~面積增速，這就意味著新疆野蘋果增大了對光合作用的投資，氮添加解除了新疆野蘋果的氮限制。當(dāng)?shù)吭黾拥絅40水平時，這種總?cè)~面積的增速顯著降低，回到對照組水平，這表明野蘋果在高氮處理下減少了對葉片和光合的投入。總體來說新疆野蘋果在光合方面表現(xiàn)為低中氮處理促進，高氮處理抑制的趨勢。適當(dāng)濃度的氮添加會促進植物光合以及生長，但對于高氮抑制現(xiàn)象在不同研究中表現(xiàn)差異較大，裴昊斐等［20］對香椿(Toona sinensis)幼苗的氮添加研究結(jié)果表明，高濃度氮并不會降低其與光合能力相關(guān)的性狀，而日本柳杉(Cryptomeria japonica)和赤松(Pinus densiflora)在高氮條件下光合活動受到明顯抑制［32-33］。這說明了不同物種對氮添加的響應(yīng)敏感性不同，裸子植物對氮添加響應(yīng)較敏感，而闊葉落葉喬木對氮負荷的耐受閾值較高，當(dāng)下多數(shù)實驗以氮沉降為標(biāo)準(zhǔn)去進行氮添加，從而沒能達到闊葉數(shù)的氮負荷閾值，而本研究的氮添加標(biāo)準(zhǔn)參照周邊果園的施氮量，超出了野蘋果的承受閾值，從而對野蘋果產(chǎn)生負面效應(yīng)。也有研究表明，不均衡的養(yǎng)分添加會對植物的光合特性以及產(chǎn)量造成負面效應(yīng)［34］，高氮抑制可能也是肥力不均衡的一種體現(xiàn)。

從整體上看，氮添加下新疆野蘋果葉性狀變異不大，其更偏向于在單葉水平產(chǎn)生變異。BD-LA、BD-SLM和BD-LI這3組的異速生長關(guān)系表明：各處理組間的斜率均沒有顯著差異，這表明各指標(biāo)間均遵循著一定的增速比例生長。BD-LI 性狀對的低、中氮處理曲線顯著的向上偏移，BD-LA 和BD-SLM組的低、中氮處理曲線向下偏移。在一定基徑下，低氮處理組擁有最大的出葉強度，最小、最輕的葉片，中氮處理組次之，而高氮處理組的出葉強度較低于對照組，其葉片數(shù)量少但葉面積較大、葉片較重。體現(xiàn)出了在不同氮濃度條件下新疆野蘋果葉大小與出葉強度之間的權(quán)衡，這種權(quán)衡關(guān)系與曾郅瑋等［35］的研究相符。結(jié)合L-TLA的增速改變，低、中氮處理組的總?cè)~面積存在增長的趨勢與潛力。在高氮處理下則出現(xiàn)了不同于低中氮處理的響應(yīng)趨勢，所有性狀對中高氮處理下新疆野蘋果葉性狀的增速與分配格局相對于對照組沒有顯著差異。甚至在同等基徑的出葉強度上相對于對照組出現(xiàn)了降低趨勢，對新疆野蘋果的生長產(chǎn)生了負效應(yīng)，對照組的氮限制與高氮處理組的氮抑制使新疆野蘋果呈現(xiàn)出了同等水平的枝葉關(guān)系。

4 結(jié)論

新疆野蘋果幼苗在低中氮處理下某些敏感的小枝性狀有上升趨勢，尤其是對于莖的投入加大，而高氮處理下小枝性狀多無上升趨勢，且枝葉間的異速生長關(guān)系也表明了高氮處理下新疆野蘋果枝葉關(guān)系的響應(yīng)不同于低、中氮處理，對新疆野蘋果生長產(chǎn)生負效應(yīng)的趨勢。適當(dāng)添加氮肥可改善枝葉生長狀況和枝葉功能性狀相互關(guān)系，建議在新疆野蘋果人工幼苗栽種過程中適當(dāng)添肥，但需要避免氮肥過度施加；在原生境移植過程中，要考慮到生境之間的差異，開展針對性施肥，以維持新疆野蘋果幼苗的良好生長狀態(tài)，降低新疆野蘋果幼年個體的死亡率。探究新疆野蘋果幼苗對氮添加的響應(yīng)，可為其種群恢復(fù)與保育提供有力的理論支撐。新疆野蘋果枝葉大小關(guān)系對不同劑量氮添加的內(nèi)部響應(yīng)機制以及科學(xué)合理的施肥方式還有待進一步探究。