呼吸道感染常見細(xì)菌分泌MPT64蛋白或其抗原類似物情況分析

徐杰平 劉雪玲 黃土星 陳龍輝 李秀群 杜青林

1清遠(yuǎn)市清新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，清遠(yuǎn) 511800；2清遠(yuǎn)市清新區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，清遠(yuǎn) 511800

結(jié)核病侵?jǐn)_人類至少有7 000余年的歷史，雖然人們在結(jié)核病控制中已經(jīng)取得了非常重大的成就，但迄今為止結(jié)核病仍為全球重大公共衛(wèi)生問題；而且其病原學(xué)確證率，包括最先進(jìn)的分子檢測結(jié)果在內(nèi)，一直都在60%以下［1］。因此，探討準(zhǔn)確、早期、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的結(jié)核病試驗(yàn)診斷方法一直為人們所關(guān)注。結(jié)核分枝桿菌特異性分泌蛋白MPT64不僅能準(zhǔn)確鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，而且易于在大多數(shù)結(jié)核病患者樣本中檢測到，被認(rèn)為是一種應(yīng)用前景廣闊的免疫學(xué)診斷標(biāo)志物，對其檢測方法學(xué)的研究也正層出不窮［2-3］。但是，劉少娟等［4］報(bào)道25株金黃色葡萄球菌增菌液MPT64檢測全部陽性，而孟繁榮等［5］則報(bào)道檢測痰液MPT64對肺結(jié)核診斷的特異度僅為69.44%，如此低的特異度是否來源于呼吸道其他感染病的干擾？我們的前期研究結(jié)果表明，一些肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性［6］。為確證試驗(yàn)結(jié)果，我們借鑒支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)方法原理，在前期研究的基礎(chǔ)上增加樣本量進(jìn)一步進(jìn)行深入分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1、一般資料

1.1、細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)參考株 共7株，包括ATCC25923金黃色葡萄球菌、ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC35218大腸埃希菌、ATCC29212糞腸球菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC1766嗜麥芽窄食單胞菌，由廣州市胸科醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2、臨床分離株 共80株，為2019年3月至2020年12月間清新區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、新生兒科、神經(jīng)內(nèi)科、冠心病監(jiān)護(hù)病房、心血管內(nèi)科送檢的合格痰標(biāo)本培養(yǎng)分離株，包括肺炎克雷伯菌25株、銅綠假單胞菌20株、嗜麥芽窄食單胞菌14株、大腸埃希菌9株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動(dòng)桿菌3株以及表皮葡萄球菌、奇異變形桿菌、阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌各1株。依細(xì)菌分離時(shí)間先后將樣本分為訓(xùn)練集樣本組和測試集樣本組：訓(xùn)練集樣本組為文獻(xiàn)［6］樣本，包括肺炎克雷伯菌9株、銅綠假單胞菌15株、嗜麥芽窄食單胞菌8株、大腸埃希菌8株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動(dòng)桿菌3株、表皮葡萄球菌以及奇異變形桿菌各1株；測試集樣本組則包括肺炎克雷伯菌16株、銅綠假單胞菌5株、嗜麥芽窄食單胞菌6株和大腸埃希菌、阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌各1株。

2、方法

2.1、細(xì)菌分離培養(yǎng)和菌種鑒定 痰標(biāo)本細(xì)菌分離培養(yǎng)采用廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板進(jìn)行，細(xì)菌鑒定應(yīng)用法國梅里埃ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和API 20E、API 20NE、APISTAPH目測鑒定紙條進(jìn)行，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按儀器與試劑說明書進(jìn)行。

2.2、菌落生理鹽水沖刷液制備和凍存 選取3～4處細(xì)菌生長旺盛區(qū)，每次選擇一處用滅菌生理鹽水約0.3 ml輕輕沖洗菌落，浸潤3～5 min，吸入1支凍存管，如此反復(fù)3～4次，-20℃凍存細(xì)菌菌落沖洗液3～4管。標(biāo)準(zhǔn)參考菌株復(fù)蘇培養(yǎng)及菌落生理鹽水沖洗液制備均委托廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.3、MPT64檢測 在冰箱中取出-20℃凍存的細(xì)菌菌落沖洗液，室溫凍融30 min，37℃水浴約15 min，等完全溶解后應(yīng)用杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的凱必利結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒進(jìn)行MPT64檢測，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。其中7株細(xì)菌參考菌株菌落沖洗液MPT64檢測委托廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；文獻(xiàn)［6］已檢測的陰性和陽性結(jié)果樣本不再實(shí)施檢測而沿用原來檢測結(jié)果，對其1例可疑結(jié)果樣本進(jìn)行重新檢測。

3、數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用頻數(shù)分布分別對訓(xùn)練集樣本、測試集樣本和全部檢測樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，計(jì)算其MPT64陽性檢出率（%）。

結(jié) 果

1、參考菌株菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測

ATCC29212糞腸球菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性，ATCC25923金黃色葡萄球菌、ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC35218大腸埃希菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC1766嗜麥芽窄食單胞菌等菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結(jié)果均陰性。

2、呼吸道感染細(xì)菌常見臨床分離株80株細(xì)菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測

訓(xùn)練集樣本組、測試集樣本組、全部樣本細(xì)菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測的陽性率分別為26.0%（13/50）、10.0%（3/30）和20.0%（16/80），具體見表1。另外，文獻(xiàn)［6］的訓(xùn)練集樣本組原1例可疑陽性的樣本，經(jīng)復(fù)核檢測結(jié)果為陰性。

表1 呼吸道感染細(xì)菌常見臨床分離株80株細(xì)菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結(jié)果（株）

討 論

MPT64最先在牛結(jié)核分枝桿菌弱毒株BCG的培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)（亦稱MPB64），為結(jié)核分枝桿菌早期高豐度分泌抗原，迄今為止的研究顯示，在分枝桿菌中，僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分泌MPT64，其他常見的可致病非結(jié)核分枝桿菌菌種則不分泌。因此，分枝桿菌培養(yǎng)濾液或菌落洗刷液MPT64檢測已成為區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌兩大菌群的準(zhǔn)確、快速、簡便試驗(yàn)方法［7-8］。由于上述呼吸道感染常見細(xì)菌與分枝桿菌分離培養(yǎng)方法完全不同，在分枝桿菌培養(yǎng)物中不會(huì)混雜這些細(xì)菌，因此本研究所顯示的某些細(xì)菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性的情形不會(huì)對結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌分群鑒定試驗(yàn)造成任何影響。

然而對于MPT64檢測，人們目前最為關(guān)注的當(dāng)屬其在結(jié)核病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用［9-10］。此時(shí)，呼吸道感染常見細(xì)菌與結(jié)核分枝桿菌分泌物則會(huì)同時(shí)出現(xiàn)于檢測樣本，本文的研究結(jié)果顯示，在80株呼吸道感染細(xì)菌常見臨床分離株中，其菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性達(dá)20.0%，在肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌中則高達(dá)25.0%。這些數(shù)據(jù)深刻表明應(yīng)用臨床樣本直接檢測MPT64在結(jié)核病診斷中將存在很高的假陽性，如何克服假陽性對結(jié)核病診斷的影響值得系統(tǒng)、深入研究。從表1我們還可看到，在訓(xùn)練集樣本組和測試集樣本組中，肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌等同種細(xì)菌其MPT64陽性檢出率大不相同；劉少娟等［4］則報(bào)道25株金黃色葡萄球菌增菌液MPT64檢測全部陽性。這些結(jié)果提示，呼吸道感染常見細(xì)菌是否分泌MPT64或其抗原性類似結(jié)構(gòu)物，同種細(xì)菌具有相當(dāng)大的個(gè)體差異性。同種細(xì)菌所表現(xiàn)出的巨大個(gè)體差異，則大大增加了相關(guān)問題研究的難度，但我們必須努力而為之。

至于在這些呼吸道感染常見細(xì)菌分泌物MPT64檢測陽性，檢測到的究竟是結(jié)核分枝桿菌MPT64分泌蛋白還是其抗原類似物，Chikamatsu等［8］在92種非結(jié)核分枝桿菌中均未發(fā)現(xiàn)MPT64檢測陽性菌，從細(xì)菌種屬關(guān)系方向上看，在這些呼吸道感染常見細(xì)菌分泌物檢測到的MPT64應(yīng)為其抗原類似物居多。從MPT64分泌通道看，其主要通過Ⅶ型分泌系統(tǒng)（T7SS）排出菌體［11］，目前人們也發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌中有T7SS的存在［12］，而T7SS則對其作用底物有著特定的結(jié)構(gòu)要求［13］，類似于MPT64抗原性類似結(jié)構(gòu)物在這些細(xì)菌通過其T7SS分泌則存在相當(dāng)?shù)目赡苄?。不過這些都是我們對這些科學(xué)問題的樸素思考和粗淺推測，其內(nèi)在機(jī)制究竟如何，事關(guān)MPT64檢測的價(jià)值評估，意義重大，不可等閑視之，亟待深入探索。

綜而觀之，對于應(yīng)用MPT64檢測進(jìn)行結(jié)核診斷的臨床價(jià)值評價(jià)，還需要從更為多樣的細(xì)菌種類、各類真菌中展開，也需要增大各種細(xì)菌的研究樣本量，以全面深入了解其影響因素、影響程度及導(dǎo)致這些影響的內(nèi)在機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突